植物组织中阿拉伯半乳聚糖蛋白和果胶的免疫定位

取一张载玻片，其反应孔中包含不同植物组织的薄切片。这些组织已固定并包埋在树脂中，用于免疫染色。

将载玻片置于黑暗且湿润的孵育 chamber 中，以防止后续步骤中光照和试剂蒸发。

加入封闭液以防止抗体的非特异性结合。

洗涤以去除多余的封闭液，然后加入抗原特异性的初级抗体并孵育。

抗体与其靶向抗原结合，即细胞壁中的阿拉伯半乳聚糖蛋白和果胶。

加入与荧光染料偶联的二抗，使其与一抗结合。

洗涤以去除未结合的抗体，然后加入可与纤维素结合的荧光染料，标记细胞壁。

加入封片剂，并用盖玻片封片。

在显微镜下，染料和结合抗体的荧光有助于观察植物细胞壁中纤维素与阿拉伯半乳聚糖蛋白或果胶的共定位，从而展示它们在组织中的特异性分布。

为反应载玻片准备孵育室时，将一些润湿的纸巾置于移液器吸头盒底部，并用铝箔包裹该盒子。将载玻片从盒中转移至孵育室中。向每个孔中加入50 µL封闭液。将载玻片孵育10分钟后，移除封闭液。然后用PBS洗涤所有孔，每次10分钟，共洗两次。按照文稿中所述方法配制一抗溶液后，用去离子蒸馏水对各孔进行最后一次洗涤，持续5分钟。

将一抗溶液加入反应孔中。然后将封闭液加入对照孔中。盖上孵育板盖，室温孵育2小时，随后在4摄氏度冰箱中过夜孵育。用封闭液配制1%的二抗溶液，每孔约需40微升。

用铝箔覆盖溶液。用 PBS 清洗反应玻片的孔两次，每次 10 分钟，再用去离子蒸馏水清洗一次，每次 10 分钟。确保孔内无封闭液或残留物。将二抗溶液加入所有孔中。将玻片置于暗处，室温孵育 3 至 4 小时。

再次用 PBS 清洗反应玻片的各孔两次，并用蒸馏去离子水清洗一次。然后向每个孔中加入一滴荧光增白剂（calcofluor-white）。无需清洗，直接向每个孔中加入一滴封片介质，并用盖玻片覆盖各孔。使用荧光显微镜观察反应玻片中的样品切片。

每次观察时，使用紫外滤光片检测被荧光增白剂染色的细胞壁，并使用FITC滤光片检测免疫定位。为了更清晰地显示结果，可使用ImageJ或类似的图像分析软件，将每个紫外滤光片图像与相应的FITC滤光片图像进行合并。