三维水凝胶系统中包封细胞的免疫染色

取一个含有包埋在模拟天然细胞外基质环境的水凝胶系统中的哺乳动物细胞的多孔板。

移除培养基。使用固定缓冲液处理，以交联蛋白质，保持细胞完整性。

加入含有去垢剂的溶液以通透细胞膜。

加入封闭液，以防止后续步骤中发生非特异性抗体结合。

加入可进入细胞并特异性结合细胞质中间丝和目标转录因子的一抗混合物。

去除未结合的抗体。加入荧光标记的二抗和核染料，以对DNA进行荧光标记。

去除未结合的分子。

使用封片剂将水凝胶培养物固定在载玻片上。

使用共聚焦显微镜观察免疫染色的细胞。

首先，吸出每个孔中的培养基。然后，用1毫升预热的DPBS洗涤各孔。洗涤完成后，向每个孔中加入750微升固定液。随后，将24孔板在37°C下孵育30分钟。孵育结束后，吸出各孔中的固定液，并将固定液弃置于危险废物容器中。接下来，向样品中加入1毫升DPBS，立即弃入危险废物容器中。

接下来，向样品中加入 750 微升透化溶液，在室温下以每分钟 15 转的速度在摇床上透化一小时。一小时后，吸除透化溶液，并向样品中加入 750 微升封闭溶液。将样品在室温下置于摇床上孵育三小时。然后，用抗体稀释液将所需的一抗进行稀释。

接下来，向每个样品中加入 500 µL 抗体溶液。在 4 °C 下孵育样品过夜。次日，吸除一抗溶液。然后，在室温下用 PBST 洗涤样品，每小时一次，共三次，每次 15 转/分钟。

接下来，将适当的二抗和5 mg/ml的DAPI储存液稀释，以获得终浓度为2.5微克/毫升的溶液。然后，向每个样本中加入500微升该溶液。接着，用铝箔包裹24孔板，并在4摄氏度下孵育过夜。

第二天，吸除二抗溶液，用 PBST 在摇床上于室温下洗涤样品三次，每次 30 分钟。接着，在玻璃载片表面滴加一滴硬封片剂，将样品置于封片剂上。最后，用指甲油将样品封固在玻璃盖片上，以防止污染或样品移动。