评估病毒来源的肽修饰抗体偶联物的细胞内分布

从粘附的人成红细胞开始。

引入病毒衍生的肽修饰抗体偶联物。这些偶联物包含来自病毒的核定位序列或 NLS 和胆酸残基。

孵育过程中，抗体偶联物与细胞表面受体相互作用并在内体内化。

结合物中的胆酸有助于逃离内体区室，实现细胞内积累，而转运蛋白和 NLS 促进其核定位。

引入胰蛋白酶和含EDTA的缓冲液以分离细胞并去除表面结合的偶联物。

加入富含血清的培养基以抑制胰蛋白酶活性。

心以收集细胞;固定并透化它们。

引入远红荧光团标记的二抗，与局部偶联物结合并洗涤。

用核染色染料处理。

在共聚焦显微镜下观察并捕获各种平面深度的图像。

图像处理后，细胞在细胞质和细胞核内显示出小的绿色荧光病灶，确认了抗体偶联物的细胞内分布。

用200纳摩尔7G3-胆酸抗体偶联物处理靶TF-1a细胞。包括用修饰的对照单克隆抗体处理的细胞。将 5 x 10⁶ 抗原阳性细胞与偶联物在 37 摄氏度下孵育一小时。然后除去上清液，用一毫升冰冷的PBS洗涤细胞三次。

加入新鲜培养基，将细胞在37摄氏度下再孵育一小时。接下来，加入0.5毫升含有0.25%胰蛋白酶和EDTA的PBS，并将细胞在37摄氏度下孵育长达30分钟。然后，使用含有 10% FBS 的 1.5 毫升 RPMI-1640 培养基中和胰蛋白酶。

500 倍 g 离心细胞 5 分钟。除去上清液，用0.5毫升冰冷的PBS再次洗涤细胞三次。向细胞中加入0.5毫升1%PFA和1%蔗糖PBS，并将它们放在冰上30分钟以固定它们。

然后用0.5毫升冰冷的PBS洗涤细胞3次，并以250倍g 离心样品5分钟。接下来，将 0.15% Triton X-100 中的 PBS 加入细胞中，并在冰上透化五分钟。然后用冰冷的PBS，洗涤细胞并重复离心。

细胞悬浮在0.1毫升PBS中，其中每毫升含有2微克与AlexaFluor 647偶联的抗鼠Fc二级多克隆抗体，并将样品在室温下在黑暗中孵育一小时。将细胞以250倍g离心5分钟，并使用0.5毫升冰冷PBS洗涤细胞3次。

然后将细胞重悬于 0.5 毫升 PBS 中。向细胞中加入每毫升10微克碘化丙啶。然后，使用封固剂将 1 x 10⁵ 个细胞安装到载玻片上，然后用玻璃盖玻片覆盖样品。在倒置激光扫描共聚焦显微镜上，使用 Plan Apo 60X 油浸物镜（数值孔径 1.42）检查细胞。

使用 488 纳米氩激光器和设置为 600 至 650 纳米的光谱扫描棱镜检测 PI 荧光。对于 AF 647 荧光，请使用 633 纳米氦氖激光和设置为 650 至 700 纳米的光谱扫描棱镜。从 P1 和 AF 647 依次收集图像，1024 x 1024 像素，在整个细胞厚度上以 0.5 微米的间隔拍摄 2X 线平均。将图像呈现为 Z 投影。

为了分析细胞，评估并记录细胞质中的细胞内荧光是分组的并靠近细胞表面还是弥漫性和均匀的。此外，评估每个细胞的相对荧光强度。