一种体外检测吞噬细胞介导的抗体依赖性细胞吞噬作用的实验方法

取用荧光标记的微球，该微球偶联有目标抗原。固定的抗原可与抗原特异性抗体结合。

加入白细胞，包括非吞噬性淋巴细胞、吞噬性粒细胞和单核细胞。在生理条件下孵育混合物。

固定化的抗体的 Fc 区域与吞噬细胞上的 Fc 受体结合，从而触发抗体依赖性细胞吞噬作用（ADCP）。

离心以沉淀细胞，并弃去含有未内化微球的上清液。

加入一种可进入死细胞并使其产生荧光标记的活率染料。

离心以沉淀细胞，并移除上清液。

加入可与白细胞结合的荧光标记抗体。

离心以弃去上清液并固定细胞。

通过流式细胞术，首先去除对活力染色呈阳性的死细胞。

然后，根据细胞的颗粒度和散射特性，选择有活力的白细胞，并区分粒细胞、单核细胞和淋巴细胞。

通过测量微球阳性吞噬细胞的荧光强度来定量其抗体依赖性细胞介导的吞噬作用（ADCP）活性。

进行ADCP实验时，在最后一次离心后，迅速倒置已制备好的ADCP板以倾去上清液，随后在200微升含BSA的PBS中加入5 × 10⁴个 freshly isolated breastmilk cells，在37摄氏度下孵育2小时。

孵育结束后，离心细胞，并用200 µL新鲜PBS重悬沉淀，洗涤两次，操作如图所示。最后一次洗涤后，在避光条件下，室温孵育30分钟，每孔加入0.5 µg/mL可固定活力染料450和50 µL PBS对细胞进行染色。

孵育结束后，如所示，用新鲜 PBS 将细胞沉淀并清洗两次，并在室温下避光孵育 30 分钟，对目标白细胞标志物进行染色。孵育结束后，通过离心收集细胞，并用 200 µL 含 1% BSA 的 PBS 洗涤细胞两次，每次洗涤均使用 200 µL。

最后一次洗涤后，每孔加入 200 微升 0.5% 多聚甲醛，在室温下避光固定 30 分钟。进行细胞样品的流式细胞术分析时，设置配备高通量板式进样器的流式细胞仪，每孔吸取 175 微升样品，并每孔收集 5,000 个细胞。

在前向散射光与侧向散射光图上进行初始设门，以排除双联体和碎片。利用侧向散射光与活力染料图排除死细胞，并通过侧向散射光与CD45图区分主要的白细胞类别。

对于所有 CD45 阳性细胞，或每个感兴趣的白细胞亚群，通过在结合珠的相应荧光通道直方图中，对珠阳性细胞的标记物设门，来测定抗体依赖性细胞吞噬活性。然后，通过珠阳性细胞的荧光强度中位数乘以 CD45 阳性细胞群占总细胞百分比，计算抗体依赖性细胞吞噬评分。