利用钙离子指示剂染料评估T细胞受体诱导的钙离子内流

从鼠源T细胞悬液开始，加入钙离子指示剂染料—— Indo-1-乙酰氧基甲酯。

染料进入细胞后，细胞内的酯酶会切割乙酰氧基甲基基团，形成不可透过细胞膜的Indo-1，该物质在无钙和结合钙状态下表现出不同的荧光特性。 

加入Fc受体抗体以阻断非特异性结合位点。

加入荧光标记的抗体以染色T细胞亚群。

去除未结合的抗体，并使用能够区分活细胞和死细胞的活力染料进行染色。 

在流式细胞术中，首先检测活细胞的微弱荧光并鉴定荧光染料标记的T细胞，随后测量这些细胞内Indo-1的荧光强度。

使用抗CD3抗体处理，该抗体与T细胞受体CD3复合物相互作用，激活T细胞信号通路，诱导钙离子流入胞质溶胶。

Indo-1 染料与释放的钙离子结合，使染料的荧光从蓝色转变为紫色。

Indo-1 荧光从无钙状态到钙结合状态的转变证实了T细胞受体诱导的钙离子内流。

首先，通过将 50 微升 DMSO 加入含有 50 微克 Indo-1 AM 的小瓶中，配制浓度为 1 微克/微升的 Indo-1 AM 储存液。然后将该储存液用 cRPMI 稀释至适当体积，使其终浓度为 6 微克/毫升。

将培养基置于37摄氏度的水浴中。然后，用该培养基以1:1的比例稀释预先制备的细胞悬液，使细胞浓度达到每毫升500万至600万个。接着，向12孔组织培养板中每孔每实验条件加入1毫升细胞悬液。

通过向负载了无钙 Indo-1 AM 染料的细胞中加入 EGTA，制备单染色对照样本。使用不含荧光染料或 Indo-1 染料的样本设置生物学阴性对照孔。在流式细胞仪上，向负载染料的细胞悬液中加入浓度为 50 微摩尔的离子霉素，制备 Indo-1 阳性对照。

此外，使用抗体偶联的荧光染料为其他细胞群体制备单染对照孔。然后每百万个细胞加入2微克的Fc受体阻断抗体，并将培养板孵育45分钟，每隔15分钟轻敲培养板以重新悬浮细胞。

孵育后，混匀并吸出孔板中的全部细胞悬液，转移至1.7毫升微量离心管中。离心后弃去上清液。用1毫升预热的cRPMI洗涤细胞一次，再次离心并弃去上清液。

将细胞重悬于1毫升cRPMI中，并将每支试管孵育，试管盖略微打开以利于气体交换，确保细胞内AM酯完全去酯化。随后，配制所有用户自定义荧光染料偶联抗体的混合液，并将其加入静息细胞中，每1毫升细胞体积加入该混合液。

静置后，离心收集细胞，加入1毫升预冷至4°C的cRPMI重悬沉淀进行洗涤。重复此步骤一次，并将离心管置于冰上。使用带盖的5毫升聚苯乙烯流式管，将各单个样本重悬于500微升酚红-free cRPMI中。

为了在钙流分析中维持温度，通过将浴珠加入小型水浴中来制备珠浴，并将其加热至37摄氏度。小心地将一个50毫升的锥形管切成两半，丢弃管的上半部分。用浴珠填充剩余管体的3/4，并将其放入珠浴中，使其温度达到37摄氏度。

将珠浴放置在流式细胞仪附近，并配备一个泡沫架用于固定试管。在进行流式细胞仪分析前，将每支试管单独在37摄氏度下预热七分钟。登录流式细胞仪软件，然后点击库选项卡。

然后，选择荧光标记以添加钙结合的Indo-1和无钙Indo-1。接着，在荧光标记组中选择紫外激光，并点击添加以添加荧光标记名称。选择激光激发波长和发射波长，然后点击保存。

继续进行实验设置。单击采集选项卡。打开或创建一个新的实验，并将所需的荧光标签添加到实验中。为实验创建一个参考组和一个新的样本组，并对这两个组进行标记。

在采集选项卡下，将记录事件数设置为最大值1000万，停止体积设置为最大3,000微升，停止时间设置为最长36,000秒。采集用户自定义的偶联抗体单染对照，这些抗体包含在多色检测面板中，同时采集Indo-1功能染料的单染对照。

向钙结合的 Indo-1 阳性对照中加入 50 微摩尔的离子霉素并涡旋混匀。将流式管放入样品进样板，然后点击 记录。接着，将无钙 Indo-1 阴性对照加入流式细胞仪，并点击 记录。

单击解混按钮，对单染对照样本进行解混。解混完成后，使用解混后工作表创建连续图谱，例如SSCA对FSCA以去除样本中的碎片，以及SSCA对SSCH以去除双联体。

然后通过点击图谱创建设门。在工作表中添加图谱，双击门内区域以创建下游的设门细胞群。重复此步骤，直至所有目标细胞群均被圈选。接下来，将先前制备的单染对照样本加热至37摄氏度，以进行连续分析。

设置流式细胞仪软件，并运行去离子水 2 至 3 分钟，以确保流式细胞仪的流体系统稳定。在未混合的工作表中，通过使用多边形、矩形或椭圆门控工具创建门控，设置连续的图谱，以包含目标细胞群。

双击门内区域，将 y 轴和 x 轴参数更改为 SSCA 与 SSCH。通过左键单击坐标轴完成坐标轴参数的设定。创建 SSCA 与活力染料信号的散点图。圈选活细胞群体，即不被胺类染料染色或染色呈阴性的细胞。

活细胞在活/死染色中呈阴性，将聚集在y轴和x轴的零标记处。双击内侧图以创建一个新图，该图仅包含单个活淋巴细胞。将y轴改为一，x轴改为时间，以可视化钙离子内流情况。

接下来，将预热的生物样本放入仪器的样品导入管（SIT）中。以中等流速运行样本，速率为每秒 2,500 至 3,000 个事件，以在有限数量的细胞群体中观察钙离子内流情况。将下一个样本管加入微珠浴中。

在采集控制中，点击记录以记录30秒的初始数据，获取样品中钙信号的基础水平。然后点击停止，并将管路从样品进样口移开。向样品管中直接加入30微克未偶联的抗CD3抗体，以启动钙离子内流。

迅速将试管放回样品进样口，并在软件中点击记录。记录七分钟数据，同时观察软件中采集控制区域显示的已用时间。然后在软件中点击停止。