0 次观看 • 4:24 分钟 • July 8th, 2025
取一支含有人肠道细菌悬液的试管。
加入人诺如病毒样颗粒（VLPs）。VLPs 含有完整的病毒衣壳，但缺乏基因组 RNA，因此对人类无感染性。
孵育期间，病毒样颗粒（VLP）衣壳蛋白结合于细菌表面表达的特定碳水化合物，形成VLP-细菌复合物。
离心以沉淀复合物，并弃去未结合的病毒样颗粒（VLPs）。
加入含蛋白质的封闭液以封闭非特异性抗体结合位点，从而减少后续步骤中的背景染色。
加入荧光标记的VLP特异性抗体并孵育。
抗体结合至VLP衣壳上的靶位点，标记VLP-细菌复合物。
离心以沉淀复合物。弃去未结合的抗体，将沉淀重悬于流式细胞术缓冲液中。
使用流式细胞仪检测VLP-细菌复合物发出的荧光信号，从而定量分析样品中结合细菌的百分比。
按照文稿中所述准备试剂、抗体和细菌后，将所有材料置于BSL II级生物安全柜中进行组装。
人诺如病毒的病毒样颗粒被列为生物安全等级II级病原体，所有使用病毒样颗粒的操作均应在经过认证的生物安全柜中进行。
向每管细菌中加入10微克人诺如病毒VLPs，用移液器充分混匀。37摄氏度下孵育1小时，持续旋转。孵育结束后，于10,000 × g离心 g 5 分钟。
吸弃上清液，并将细菌沉淀重悬于1毫升PBS中。重复洗涤步骤一次后，再次于10,000 × g离心试管 g 孵育5分钟。弃去上清液，将VLP细菌沉淀重悬于150微升5%封闭缓冲液中。
常见的错误是试管被混淆，导致添加了错误的处理试剂。为避免此问题，应将所有试管按对应处理方式排成行，并一次性向各试管中加入同一种处理试剂。
对于每种细菌样品，准备 50 微升稀释的人诺如病毒 G2 抗体。使用 5% 封闭缓冲液，将抗体按 1 比 125 的比例稀释，用于 E. coli 样品。针对每种细菌样品，使用相同的稀释比例，准备 50 微升稀释的同型抗体。将每个黏附实验样品转移至洁净的 1.5 毫升离心管中，分成每份 350 微升的等分试样。
为制备未染色对照，向每种细菌样品的第一个等分试样中加入 50 微升封闭缓冲液。对于染色样品，向第二组等分试样中加入 50 微升 G2 抗体稀释液。为制备同型对照，向第三组等分试样中加入 50 微升稀释后的同型抗体。
将所有样品置于冰上避光孵育30分钟。然后，以10,000 × g 离心5分钟。弃去上清液，并将每份样品重悬于150微升FCSB中。再次以10,000 × g 离心5分钟。再次弃去上清液，将样品重悬于100微升FCSB中。
将样品最终离心一次后弃去上清液，用150 µL FCSB重悬样品。将每个样品转移至含有400 µL FCSB的离心管中，使总体积达到550 µL。将样品置于4 °C保存，直至进行流式细胞术分析。