一种在转基因线虫中检测线粒体自噬的活体实验方法

取转基因线虫，其体壁肌细胞表达绿色荧光标记的 DCT-1（一种线粒体外膜蛋白）和红色荧光标记的 LGG-1（一种吞噬泡膜蛋白）。

将线虫放置在含有线粒体自噬诱导药物的生长培养基上。

该药物会损伤细胞线粒体，从而启动线粒体自噬，即选择性清除受损的线粒体。

受损线粒体上的 DCT-1 会发生泛素化和磷酸化，从而促进其与吞噬体膜上的 LGG-1 相互作用。

吞噬泡围绕线粒体扩张，形成靶向溶酶体降解的自噬体。

将线虫置于载玻片上的麻醉剂中以使其固定，并盖上盖玻片。

在荧光显微镜下观察肌细胞内出现的黄色斑点，表明发出绿色荧光的DCT-1与显示红色荧光的LGG-1共定位，由此证实线粒体自噬的发生。

在第一天，挑选在体壁肌细胞中同时表达 DCT-1::GFP 和 DsRed::LGG-1 的转基因动物的 L4 期幼虫，将其转移至接种了 OP50 的线虫生长培养基平板上。每个 3.5 厘米的平板放置 5 到 10 条线虫，至少使用三个平板。操作完成后，将线虫置于 20 摄氏度条件下培养。

接下来，在第5天，通过挑选15至20条L4期转基因幼虫，并将其转移至新鲜涂布OP50的大肠杆菌平板上，以实现线虫的同步化。每种实验条件至少使用5个平板。在第7天，准备部分溶剂对照平板用于施加感兴趣的线粒体自噬影响药物，另准备部分平板作为阳性对照。

接下来，将接种了大肠杆菌（E. coli）的平板置于强度为222微瓦/平方厘米的紫外光下照射15分钟，以确保平板上的线粒体自噬诱导化合物不会被细菌代谢。然后，取10 µL目标化合物加至接种平板的表面，同时在对照平板上加入等量的化合物溶剂作为阴性对照。

为诱导线粒体自噬提供阳性对照，加入百草枯（一种线粒体毒性物质）。轻轻摇晃培养板，使溶液覆盖整个表面，并将盖子闭合的培养板在室温下静置干燥至少一小时。干燥后，将10至20只出生两天的转基因成年动物转移至培养板中，在20摄氏度条件下孵育两天。

第9天，制备2%琼脂糖垫，并在每个垫上加入1滴含有20毫摩尔左旋咪唑的M9溶液。将转基因动物置于M9-左旋咪唑液滴中以固定样本用于成像。然后，轻轻将盖玻片覆盖在液滴上方。将样品置于共聚焦显微镜载物台上，在63倍放大条件下采集Z轴层扫图像，观察单个体壁肌细胞。