一种用于蛋白质生物标志物检测的毛细管电泳免疫分析法

为了检测与疾病相关的蛋白质生物标志物，取一块免疫测定板。

该胶板含有预先填充的分离胶和浓缩胶基质，可用于基于分子大小的蛋白质分离。

将蛋白质和免疫检测试剂分别加入到不同的孔板孔中。

在CEI分析仪内启动运行。分析仪中的毛细管卡盒会吸入基质，在每根毛细管内形成凝胶。

毛细管随后吸取蛋白质。在电泳过程中，蛋白质根据其分子量迁移并分离。

分析仪引入紫外光，使毛细管中的蛋白质固定。

洗涤缓冲液可去除基质和未结合的蛋白质。随后加入封闭缓冲液，封闭非特异性结合位点。

分析仪首先引入与生物标志物结合的特异性抗体，随后引入与特异性抗体相互作用的辣根过氧化物酶标记的二抗。

洗涤后加入化学发光底物。过氧化物酶氧化底物，产生发光。

测定发光强度，并将其与蛋白质标准品进行比较以检测生物标志物。

收集肌萎缩侧索硬化症（ALS）患者和健康受试者的人体血小板裂解液各 100 微升后，填写实验室自制的毛细管布局和样品制备模板。样品混合制备表为动态表格，将自动计算需从原液中移取的体积。除标准品试剂盒应置于室温外，所有检测试剂均需置于冰上。

配制荧光预混液时，向一支含有DTT的透明管中加入40微升去离子水，并向检测试剂盒中的粉红色管中加入20微升10X上样缓冲液和20微升已配制的400毫摩尔DTT溶液。

为制备生物素标记的分子量标准，向试剂盒中提供的白色管内加入16微升去离子水、2微升10X上样缓冲液以及2微升已配制的400毫摩尔DTT溶液。轻轻混匀后，将该分子量标准溶液转移至200微升PCR管中，再进行变性处理。

向一个600微升的微量离心管中加入1.5微升10X上样缓冲液和148.5微升去离子水，涡旋混匀，然后将管子置于冰上。按照表格中的指示，将目标抗体直接加入稀释液中，并多次吹打移液器吸头，以获得均一的抗体溶液。

为制备毛细管样品混合液，打开所有 PCR 管，使用反向移液技术，按照表格所示，向每管中加入 1.6 微升的 5X 荧光样品缓冲液，并在加入缓冲液后立即关闭各管。当所有缓冲液添加完毕后，再次打开所有 PCR 管，按照表格所示体积加入 0.1x 样品缓冲液，并在加入缓冲液后立即关闭各管。

接下来，打开所有离心管，按照表格所示加入蛋白样品，并立即盖紧各管盖。待所有样品加样完毕后，在台式离心机中将所有离心管短暂离心。涡旋振荡以混匀，再次离心样品。

第二次离心结束后，将所有离心管放入带有加热盖的PCR仪中，在指定条件下对样品进行变性处理。变性结束后，再次进行离心、混匀和离心，然后将所有离心管置于冰上的试管架中。

参照图示，向 D1 孔中加入 10 µL 链霉亲和素-辣根过氧化物酶，向 D2 至 D5 孔中各加入 10 µL 对应的二抗，向 B 行各孔及 C1 孔中各加入 10 µL 抗体稀释液，向 C2 至 C25 孔中各加入 10 µL 对应的一抗，向 A1 孔中加入 5 µL 来自 PCR 管 1 的生物素化分子量标记物，向 A2 至 A25 行各孔中加入 3 µL 样品，向 E 行各孔中加入 15 µL 新鲜配制的鲁米诺过氧化物。

将样品混合物和试剂按照正确的顺序移液至微小孔中对实验成功至关重要，因此应非常小心地进行操作。

然后向每个指定的洗涤缓冲液孔中加入 500 µL 洗涤缓冲液，并通过离心沉淀板内物质。