多重免疫荧光成像分析免疫治疗耐药 T 细胞亚群

以肾细胞癌组织冷冻切片为例，在其肿瘤微环境中显示浸润的 CD8+ T 细胞。

用丙酮处理以固定和透化组织。清洗以去除多余的丙酮。

添加亲和素使内源性组织生物素饱和。接下来，添加生物素以阻断固定的亲和素结合位点，最大限度地减少非特异性相互作用。

应用含有免疫球蛋白的血清阻断免疫细胞Fc受体，防止非特异性抗体结合。

添加靶向 CD8（一种细胞毒性 T 细胞标志物）以及 PD-1 和 Tim-3（由对免疫治疗耐药的 CD8+ T 细胞亚群表达的抑制性受体）的一抗混合物。

引入靶向抗 CD8 和抗 Tim-3 抗体的不同荧光团标记的二抗。

添加靶向抗 PD-1 抗体的生物素化二抗和与生物素结合的不同荧光团标记的链霉亲和素。

将含染料的封片剂涂在细胞核染色并放置盖玻片。

获取多光谱荧光图像以识别肿瘤浸润的 CD8+ T 细胞和表达 PD-1、Tim-3 或两者的免疫治疗耐药亚群。

解冻后，用纸巾小心地擦干组织切片周围的载玻片，并用疏水屏障笔包围组织。屏障干燥后，将样品固定在 100% 丙酮中 5 分钟，然后风干 2 分钟。然后，在 TBS 中清洗载玻片 10 分钟。

用三滴 0.1% 亲和素在黑暗中预处理载玻片 10 分钟。然后，轻敲或轻弹载玻片，用亲和素溶液覆盖组织。向每个样品中加入三滴 0.01% 生物素，然后在样品上轻敲或轻弹生物素，然后进行 TBS 洗涤，如刚才所示。然后，在室温下用 TBS 中的 100 微升 5% 正常血清阻断任何非特异性结合 30 分钟。

孵育结束时，轻敲载玻片以去除多余的血清，并将载玻片在 100 微升感兴趣的一抗混合物中在加湿室中孵育 1 小时。在TBST中洗涤抗体标记的载玻片5分钟。

干燥后，在加湿室中用 100 微升感兴趣的二抗混合物标记细胞 30 分钟，然后在 TBS 中洗涤 10 分钟。将干燥的二抗标记载玻片与 100 微升感兴趣的三抗混合物一起孵育 30 分钟，然后进行最后 10 分钟的 TBS 洗涤。

洗涤结束时，干燥载玻片，并用补充 DAPI 的封固剂安装纸巾。然后，用盖玻片盖住每张载玻片，让封片介质凝固至少 2 小时。

要扫描载玻片，请打开显微镜软件，然后加载图像扫描协议。将第一张载玻片加载到显微镜载物台上。然后，在控制栏中，单击"设置曝光"，并调整每个滤镜的曝光时间，直到获得足够但不饱和的信号。

单击上方面板中的"开始"，然后打开实验室 ID 文件夹。输入第一张幻灯片的 ID，然后单击下一步。

要以 4 倍放大倍率在明场光下获取载玻片的概览，请单击单色成像和查找标本。要选择要扫描的组织区域，请按 Control 键，然后使用光标选择或取消选择要以 4 倍放大倍率扫描的感兴趣区域。

要获得每个区域的荧光红-蓝-绿图像，请单击"低功耗成像"。对于高倍场选择，按 Control 键，然后选择至少五个感兴趣区域，这些区域对应于将在 20 倍放大倍率下扫描的组织区域。

然后，要获得每个场的多光谱图像采集，请单击"高功率成像"，然后单击"数据存储"以将图像存储在相应的实验室 ID 文件夹中。