多重免疫荧光成像分析对免疫治疗耐药的T细胞亚群

取一块肾细胞癌组织冰冻切片，其肿瘤微环境中可见浸润的CD8+ T细胞。

用丙酮处理以固定并通透组织。洗涤以去除多余的丙酮。

加入亲和素以饱和内源性组织生物素。接着加入生物素以阻断固定的亲和素结合位点，最大限度减少非特异性相互作用。

加入含有免疫球蛋白的血清以阻断免疫细胞的 Fc 受体，防止非特异性抗体结合。

加入靶向 CD8（一种细胞毒性 T 细胞标志物）以及 PD-1 和 Tim-3 的一抗混合液，后两者是由对免疫治疗耐受的 CD8+ T 细胞亚群表达的抑制性受体。

引入针对抗CD8和抗Tim-3抗体的不同荧光标记二抗。

加入靶向抗PD-1抗体的生物素化二抗以及与生物素结合的、带有不同荧光标记的链霉亲和素。

加入含染料的封片剂以染色细胞核，并盖上盖玻片。

获取多光谱荧光图像，以鉴定肿瘤浸润性CD8+ T细胞以及表达PD-1、Tim-3或同时表达两者的免疫治疗耐药亚群。

解冻后，用纸巾小心擦干组织切片周围的玻片，并用疏水屏障笔在组织周围画圈。待屏障干燥后，将样本置于100%丙酮中固定5分钟，随后室温晾干2分钟。然后，将玻片在TBS中洗涤10分钟。

在避光条件下，向切片滴加三滴 0.1% 亲和素溶液，预处理 10 分钟。然后轻敲或轻弹切片，使亲和素溶液覆盖组织。每个样本再加三滴 0.01% 生物素溶液，并轻敲或轻弹使生物素均匀覆盖样本，随后用 TBS 缓冲液洗涤，操作方法如前所述。接着，在室温下用 100 微升含 5% 正常血清的 TBS 溶液封闭非特异性结合位点，孵育 30 分钟。

孵育结束后，轻敲载玻片以去除多余的血清，并在湿盒中加入100 µL目标一抗混合液，孵育1小时。随后将标记抗体的载玻片在TBST中洗涤5分钟。

干燥后，在湿盒中加入100微升目标二抗混合液，标记30分钟，随后用TBS缓冲液洗涤10分钟。将干燥后的二抗标记载玻片与100微升目标三抗混合液在湿盒中孵育30分钟，最后再用TBS缓冲液洗涤10分钟。

洗涤结束后，将玻片干燥，并用含 DAPI 的封片剂封片。然后，为每张玻片加盖盖玻片，静置封片剂至少 2 小时使其固化。

扫描玻片时，打开显微镜软件并加载图像扫描程序。将第一张玻片放置在显微镜载物台上。然后在控制栏中点击设置曝光，并调节每个滤光片的曝光时间，直至获得足够但未达到饱和的信号。

单击上方面板中的 开始，然后打开实验编号文件夹。输入第一张载玻片的编号，然后单击 下一步。

要以4倍放大倍数在明场光下获取载玻片的概览图像，请点击黑白成像和寻找样本。要选择待扫描的组织区域，请按住Control键，并使用光标选择或取消选择需以4倍放大倍数扫描的兴趣区域。

为了获得每个区域的荧光红-蓝-绿图像，请点击低倍成像。 进行高倍视野选择时，按住 Control 键，并选择至少五个与将在 20 倍放大下扫描的组织区域相对应的兴趣区域。

然后，为了获取每个视野的多光谱图像，单击高倍成像，再单击数据存储，将图像保存至相应的实验编号文件夹中。