一种用于感染细胞中病毒蛋白定位的免疫荧光技术

从一张含有贴壁宿主细胞的载玻片开始。

加入病毒，并使其进入宿主细胞。

移除用过的培养基。加入新鲜培养基以促进病毒蛋白的合成与转运。

使用多聚甲醛固定细胞形态和蛋白质定位。

加入去垢剂分子以使细胞通透。

加入封闭缓冲液以封闭非靶标结合位点。

加入可结合目标病毒蛋白的一抗。去除未结合的一抗。

使用红色荧光染料标记的二抗进行孵育，以荧光标记病毒蛋白。去除未结合的抗体。

加入含有荧光核染料的封片剂以染色细胞核。

利用共聚焦显微镜观察红色荧光病毒蛋白和蓝色荧光宿主细胞核的位置。

蓝色区域周围较强的红色信号表明细胞质定位，而内部较强的信号则提示细胞核定位。

蓝色区域内外信号强度相等，表明蛋白质位于细胞核和细胞质中。

病毒感染前20至24小时，在生长培养基中，于37摄氏度、5%二氧化碳条件下过夜培养，将5 × 10⁴个人类胚胎肺（HEL）成纤维细胞接种至4孔11毫米错列式载玻片的每孔中。

轻轻摇动载玻片至关重要，以确保细胞均匀分布，同时注意避免培养基溢出。次日，将70%至80%汇合度的培养物上清液更换为含有每细胞4-10个空斑形成单位的Medium-199，并将载玻片置于37摄氏度下振荡孵育1小时。

孵育结束后，弃去上清液，加入新鲜培养基，将细胞放回培养箱中继续培养至相应的实验感染时间。对于病毒感染细胞的免疫荧光染色，先用 PBS 快速洗涤细胞 3 次，随后每孔加入 200 微升含 4% 多聚甲醛的 PBS 溶液，室温固定 8 至 10 分钟。固定结束后，每孔用 200 微升 PBS 洗涤 3 次，然后每孔加入 100 微升含 0.2% 非离子型表面活性剂的溶液，室温下透化处理 5 至 10 分钟。

按照所示方法用 PBS 洗涤透化的细胞 3 次，每孔加入 200 微升封闭缓冲液，在室温下孵育 1 小时。随后，向每孔加入适当浓度的目标一抗，在室温下孵育 2 小时。

孵育结束后，用新鲜封闭缓冲液洗涤三次，每次10分钟，以去除未结合的一抗，然后在避光条件下，每孔加入适量的二抗，室温孵育1小时。

孵育结束后，如图所示，用封闭缓冲液将细胞洗涤三次，再用 PBS 洗涤一次，每孔加入一滴含 DAPI 的抗荧光淬灭封片剂。然后将盖玻片覆盖在载玻片上，并用透明指甲油密封盖玻片。

放置盖玻片时施加轻柔的压力，可去除多余的封片介质，有助于获得高质量的图像。

为了分析 ICP0 的核与细胞质分布，首先在共聚焦显微镜应用软件中打开项目并选择一幅图像。打开定量选项卡，从工具菜单中选择区域排序。选择绘制线条，并在待分析的细胞上纵向绘制一条直线。此时将显示一个直方图，呈现目标蛋白与 DAPI 沿该直线的荧光强度分布。

根据背景染色情况，为每次实验中目标蛋白的强度设定一个恒定阈值，用于分析该蛋白的亚细胞分布。如果蛋白信号在细胞核区域的平均强度低于该阈值，但在DAPI边界以外的区域高于该阈值，则将该蛋白信号归类为主要定位于细胞质中。

如果蛋白信号在整个细胞核内以及DAPI信号边界之外均高于阈值，则将该蛋白信号归类为细胞核和细胞质共定位。如果蛋白信号在细胞核内高于阈值，但在DAPI信号边界外平均低于阈值，则将该蛋白信号归类为细胞核定位。