Name: 幸免神经损伤（SNI）模型引起的机械触感小鼠 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: 了解小鼠幸免神经损伤模型建立方法，通过结扎并切断坐骨神经两个分支保留腓肠神经，利用von Frey纤维丝定量评估机械性痛觉超敏反应，为研究神经病理性疼痛机制及药物筛选提供可靠平台。

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本工作由伦德贝克基金会、嘉士伯基金会和达格玛·马歇尔基金会资助。

1. 手术前的von Frey基础值测量
关于 von Frey 测试步骤，请参见第 5 节。
2. 麻醉/准备
<ol>
	<li>麻醉动物（腹腔注射100 mg/kg氯胺酮和15 mg/kg赛拉嗪的混合物）。</li>
	<li>将动物置于安静处直至完全麻醉（例如用纸巾覆盖）。</li>
	<li>用镊子轻夹尾尖和足掌以检查反射反应。确认动物无反应后方可继续操作。</li>
	<li>皮下注射0.5 ml含抗生素（如氨苄青霉素）的等渗盐水（注射部位为背部肩部区域），以预防脱水和感染（尽管本手术为微创操作）。</li>
	<li>使用电动剃毛器，从膝关节稍下方至髋部区域剃除手术区域毛发（建议右利手操作者选择左侧后肢）。</li>
	<li>用棉签将眼用软膏涂抹于动物双眼。</li>
	<li>将动物置于右侧卧位，并将左后肢放置于一小平台上以保持抬高状态，用胶带固定肢体。</li>
	<li>从手术区域向外，交替使用乙醇和碘伏对术区进行消毒擦拭。</li>
</ol>
3. 手术
<ol>
	<li>用左手拇指定位膝关节，并使用手术刀在膝关节近端纵向做约1 cm的切口。</li>
	<li>用无菌剪刀的尖端进行钝性分离，切开皮肤。</li>
	<li>在紧邻股骨（大腿骨）附近清晰可见的血管旁，通过钝性分离打开肌层。若操作正确，肌层将轻松分开且无出血，暴露出位于肌肉下方的坐骨神经。 
	若发生出血（例如损伤了靠近膝关节的血管），请使用无菌棉签或纱布块吸除血液，并按压至出血停止。</li>
	<li>将小鼠置于体视显微镜下，用无菌镊子（编号2）小心分离肌肉组织，以暴露坐骨神经。必要时可使用牵开器。</li>
	<li>辨认腓肠神经从坐骨神经分出的区域。腓肠神经是三个分支中最小的一支，在左后肢向右侧分出。</li>
	<li>用缝线（6-0缝线）环绕其余两个仍平行走行的神经分支（胫神经和腓总神经），操作时务必避免触碰腓肠神经分支。此步骤至关重要，必须确保腓肠神经完全不受损伤。</li>
	<li>打紧外科结。若第一个结扎紧实，可观察到肢体出现收缩。</li>
	<li>用镊子（编号5）夹住需切断的神经（位于结扎线下方），然后用小型剪刀在镊子上下两端分别剪断神经。先剪断镊子上方的神经，可避免牵拉神经。</li>
	<li>用显微剪剪除缝线残端，轻柔地闭合肌层。在伤口处滴加一滴利多卡因，然后用外科结缝合伤口。</li>
</ol>
4. 术后
<ol>
	<li>检查眼膏是否仍足够。</li>
	<li>将小鼠置于干净的笼子中，并在笼子上方覆盖一张纸巾，保持其体位舒适。如果房间温度较低，可在笼子的一部分下方放置加热垫（仅覆盖部分笼底，以便动物在需要时可移动到较冷区域）。</li>
	<li>确保饮水和饲料易于获取。</li>
</ol>
5. von Frey 测试（基线测试，以及术后次日开始）
<ol>
	<li>于手术前两天和一天，将小鼠放入置于金属网桌面上的红色塑料圆筒中。测试前，在圆筒中适应15分钟。圆筒的红色有助于小鼠快速放松，因为它们彼此看不见，且处于较暗的环境中。</li>
	<li>确认小鼠处于安静状态后，使用von Frey纤维丝刺激足爪外侧：从0.02 g纤维丝开始，首先在左侧足爪上施加力量，共5次，持续30秒（每次刺激约2秒），每次刺激后观察小鼠的反应。对其他小鼠的左爪使用相同纤维丝重复此操作，然后返回第一只小鼠的右爪，再依次更换纤维丝进行测试，例如： 
	<ul>
		<li>小鼠1：使用0.02 g纤维丝刺激左爪5次</li>
		<li>小鼠2：使用0.02 g纤维丝刺激左爪5次，依此类推</li>
		<li>小鼠1：使用0.02 g纤维丝刺激右爪5次</li>
		<li>小鼠2：使用0.02 g纤维丝刺激右爪5次，依此类推</li>
		<li>小鼠1：使用0.04 g纤维丝刺激左爪5次</li>
		<li>小鼠2：使用0.04 g纤维丝刺激左爪5次，依此类推</li>
	</ul>
	</li>
	<li>五次刺激中出现三次反应即视为阳性反应。可使用高于阈值的纤维丝进一步验证阈值水平。 
	反应表现包括：足爪突然回缩、突然抖动或突然舔舐足爪。</li>
</ol>
6. 代表性结果
<img src="/files/ftp_upload/3092/3092fig1.jpg" alt="同侧、对侧和假手术组的机械痛阈（克）随时间（天）变化的折线图" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 对8-10周龄的C57BL/6小鼠在术前1天进行Von Frey测试，并在术后多次重复测试。每组包含4-8只动物。手术侧的结果以同侧表示，未手术的对照侧以对侧表示。术后第1天，动物手术侧足爪出现显著的痛觉过敏，而未手术侧相对于假手术小鼠仅有轻微影响。（* &lt;0.05，** &lt;0.01，*** &lt;0.001，同侧相对于对侧）。

<ol><li>Costigan, M., Scholz, J., Woolf, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropathic+pain%3A+a+maladaptive+response+of+the+nervous+system+to+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuropathic pain: a maladaptive response of the nervous system to damage.</a> Annu. Rev. Neurosci. 32, 1-32 (2009).</li>
<li>Decosterd, I., Woolf, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spared+nerve+injury%3A+an+animal+model+of+persistent+peripheral+neuropathic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Spared nerve injury: an animal model of persistent peripheral neuropathic pain.</a> Pain. 87, 149-158 (2000).</li>
<li>Bourquin, A. -F., Süveges, M., Pertin, M., Gilliar, N., Sardy, S., Davidson, A. C., Spahn, D. R., Decosterd, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+and+analysis+of+mechanical+allodynia-like+behavior+induced+by+spared+nerve+injury+%28SNI%29+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Assessment and analysis of mechanical allodynia-like behavior induced by spared nerve injury (SNI) in the mouse.</a> Pain. 122, 14.e1-14.e14 (2006).</li>
<li>Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+tactile+allodynia+in+the+rat+paw%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw.</a> J. Neurosci. Methods. 53, 55-63 (1994).</li>
<li>Bennett, G. J., Xie, Y. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+peripheral+mononeuropathy+in+rat+that+produces+disorders+of+pain+sensation+like+those+seen+in+man%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">A peripheral mononeuropathy in rat that produces disorders of pain sensation like those seen in man.</a> Pain. 33, 87-107 (1988).</li>
<li>Seltzer, Z., Dubner, R., Shir, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+behavioral+model+of+neuropathic+pain+disorders+produced+in+rats+by+partial+sciatic+nerve+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">A novel behavioral model of neuropathic pain disorders produced in rats by partial sciatic nerve injury.</a> Pain. 43, 205-218 (1990).</li>
<li>Hargreaves, K., Dubner, R., Brown, F., Flores, C., Joris, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+and+sensitive+method+for+measuring+thermal+nociception+in+cutanous+hyperalgesia%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">A new and sensitive method for measuring thermal nociception in cutanous hyperalgesia.</a> Pain. 32, 77-88 (1988).</li>
<li>Erichsen, H. K., Blackburn-Munro, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+characterization+of+the+spared+nerve+injury+model+of+neuropathic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Pharmacological characterization of the spared nerve injury model of neuropathic pain.</a> Pain. 98, 151-161 (2002).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

关键步骤
为研究胫神经和腓总神经损伤后完整腓肠神经的病理变化，应避免对腓肠神经造成损伤。腓肠神经的继发性损伤可能导致瘫痪，从而表现为手术侧后肢拖行。
只有足部外侧由保留的腓肠神经支配，因此仅该区域出现神经病理性改变。检测由横断神经支配的其他区域会严重干扰对机械阈值改变的评估。
可能的修饰
其他类型的结扎模型可作为研究外周神经损伤后病理性疼痛状况的补充方法，例如慢性缩窄性损伤[5]或部分神经结扎[6]。每种实验操作都会导致不同的表型改变，在术后检测前应予以充分考虑。
此外，也可应用其他感觉测试，如热痛觉过敏[7]，尽管在SNI后该表型较不显著。
未来应用
该技术可用于测试改变机械性异常性疼痛发生或维持的药物[8]。通过分析坐骨神经、背根神经节（DRG）和/或腰段脊髓，可研究导致该表型的分子机制。
动物实验遵循良好实验室规范进行，完全符合丹麦及欧洲法规。所有实验均获得丹麦司法部下属丹麦动物实验监察局的批准（许可编号 2006/561-1206）。

小鼠中诱导机械性异常性疼痛的 spared nerve injury（sni）模型

The Spared Nerve Injury (SNI) Model of Induced Mechanical Allodynia in Mice

外周神经病理性疼痛是一种严重的慢性疼痛病症，可能由周围神经系统中感觉神经受损引起。 spared nerve injury（SNI）模型可诱导产生神经病理性疼痛的症状，例如机械性异常性疼痛，即通常不会引起疼痛反应的触觉刺激引发疼痛 [1]。
SNI 小鼠模型涉及坐骨神经三个分支中的两个分支（胫神经和腓总神经）的结扎，而腓肠神经则保持完整 [2]。该损伤导致由保留的腓肠神经支配的足底外侧区域出现明显的痛觉过敏。小鼠未手术的一侧可用于作为对照。SNI 模型的优点在于其反应稳定，且不需要高超的显微外科技术。
通过使用弯曲力逐渐增加的冯·弗雷（von Frey）细丝反复按压足底外侧区域来测定机械性疼痛反应的阈值[3], [4]。由细丝刺激引发的突然缩足、抖动和/或舔足反应被定义为阳性疼痛反应。在五次重复刺激中出现三次阳性反应即定义为疼痛阈值。
如视频方案所示，C57BL/6 小鼠在术后当天即出现明显的异痛症，并可持续数周。

本文描述的 spared nerve injury（SNI）动物模型是一种小鼠模型，通过损伤坐骨神经的胫神经和腓总神经分支，保留剩余的腓肠神经完整，从而建立外周神经病理性疼痛模型。由机械性异常性疼痛引起的行为学改变通过 von Frey 纤维丝进行量化评估。

小鼠中诱导机械性异常性疼痛的 spared nerve injury（SNI）模型

外周神经病理性疼痛是一种严重的慢性疼痛病症，可能由周围神经系统感觉神经受损引起。节段...

本实验的总体目标是建立一种继发于外周神经损伤后的神经病理性疼痛小鼠模型。首先对小鼠进行麻醉，将其后肢置于适当位置并暴露坐骨神经。随后通过结扎坐骨神经的两个分支（保留第三个分支完整）来诱导特定的神经损伤。在本视频中，胫神经和 common perineal 神经被缝合并切断，而 sorel 神经得以保留。然而，在神经损伤后也可采用其他组合方式。将 Misa 置于圆柱形容器中，容器放置在金属丝网桌面上，使其适应环境，随后使用 Von Fray 实验检测，该方法可对诱发的机械性异常性疼痛进行定量评估。将校准的Von Frey纤维丝按递增顺序施加于手术侧足底外侧区域。为检测手术侧与未手术侧后肢的机械痛阈，将纤维丝刺激后出现快速足部回缩、抽动和/或舔足反应定义为疼痛反应。最终，通过绘制随时间变化的机械痛阈曲线，可直观显示手术侧肢体相较于未手术侧是否出现机械性异常性疼痛，从而便于研究外周神经损伤后不同的分子通路或药物干预效应。该方法有助于解答周围神经损伤领域中的一些关键问题，例如神经病理性疼痛发生过程中的分子通路。此外，还可用于测试旨在抑制疼痛发生或缓解疼痛症状的药物。术前两天，将小鼠置于红色塑料圆筒内，圆筒放置于安静房间内的金属网桌面上，让小鼠在测试前适应圆筒环境15分钟。适应15分钟后，确认小鼠处于安静状态，随后按递增顺序使用von Frey纤维丝，从0.02克纤维丝开始。首先对左侧足底外侧区域施加力量，5次施加共持续30秒，每次施加后观察并记录小鼠的反应；用同一根纤维丝对另一只小鼠的左足底进行相同操作，然后从右足底重新开始，再依次更换至下一根纤维丝继续测试。疼痛阳性反应定义为由细丝刺激引发的突然性足趾回缩、脚趾伸展和/或过度舔舐足部，且在五次重复刺激中有三次呈现阳性反应即定义为疼痛阈值。通过腹腔注射氯胺酮与赛拉嗪混合物使动物麻醉，并将动物置于安静处直至完全麻醉。通过用镊子夹捏尾尖和暂停动作来检查反射，确保动物无反应后方可继续操作。接下来，在皮下注射0.5毫升含抗生素的等渗盐水，以避免脱水并预防感染。使用电动剃须刀，对右利手操作者而言，将手术区域从膝部稍下方至髋部区域进行剃毛；若对左侧后肢进行操作，则可能更为方便。用棉签将眼膏涂抹于眼睛。将动物置于其右侧，左后肢放在一个小平台上以保持抬高，并用胶带固定腿部。动物体位确定后，从手术部位向外交替使用乙醇和碘伏进行擦拭消毒，然后使其干燥。用左手拇指定位膝关节，在膝关节近端沿纵轴方向用手术刀做一小切口。用剪刀尖端钝性分离切开皮肤。接下来，将小鼠置于体视显微镜下，找到靠近股骨处清晰可见的血管。然后通过钝性分离法分开肌肉层。若操作正确，肌肉层将顺利分离且无出血，从而暴露出位于肌肉下方的坐骨神经。如果因邻近血管受损而出血，可使用棉签或纱布块按压以吸收血液，直至出血停止。用2号镊子小心地分开已分离的肌肉层。必要时使用牵开器以暴露坐骨神经，观察腓肠神经从坐骨神经分出的区域。腓肠神经是左腿中向右分出的三个分支中最小的一个。在C57黑六小鼠中，用6-0缝线紧紧结扎另外两个仍平行走行的分支，注意务必不要触碰腓肠神经分支。用5号镊子夹住需切断的神经（位于结扎线以下），然后用小型剪刀先在镊子上方、再在下方剪断神经，以避免牵拉神经。神经切断后，用剪刀修剪掉结扎线的线头，然后轻轻闭合肌层。通常无需使用缝合环。在伤口处滴加一滴利多卡因，并用外科打结法缝合。检查眼药膏是否仍充足，然后将小鼠放入清洁的笼子中，并放置一张纸巾。保持舒适体位，提供易于获取的饮水和饲料。如果房间温度较低，在术后恢复一天后，将加热垫放置在笼子的一部分下方，按照采集基线数据的方法，采集手术组和假手术组小鼠的von Frey测量数据。此处展示了每组四到六只小鼠在术前一天以及术后连续两周每天的Von Frey测试结果。术后第二天，动物在手术侧（同侧）足部出现显著的机械性痛觉过敏，而未手术侧（对侧）足部则未受影响。与假手术小鼠相比，对侧的阈值略有降低，表明在手术小鼠中，MI异常性疼痛可能在较小程度上发生。观看本视频后，您应能够充分理解如何在麻醉小鼠中定位并操作S神经的分支。 fray检测法进一步提供了定量的功能性读数，可用于测试转基因动物或药物在部分外周神经损伤后的反应。

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幸免神经损伤（SNI）模型引起的机械触感小鼠

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