测量小鼠血清中针对试验性疫苗的免疫球蛋白G水平

从一个包被有测试疫苗的多孔板开始，并封闭非特异性结合位点。

采集接种了试验性疫苗的小鼠的血清样本。

该血清含有免疫球蛋白 G（IgG）抗体，可识别待测疫苗。

向包被疫苗的孔中加入梯度稀释的血清样本。

IgG 与疫苗结合。洗涤以去除未结合的抗体。

加入与IgG结合的辣根过氧化物酶标记的二抗。去除未结合的二抗。

加入显色底物。辣根过氧化物酶与底物相互作用，生成蓝色产物。

加入酸以终止反应。pH 值的变化使溶液变为黄色。

使用分光光度计测量每个孔的颜色强度，以确定血清样本中IgG的浓度。

为了进行酶联免疫吸附测定（ELISA）板的抗原包被，用包被液将HI蛋白抗原稀释至每毫升10微克，并在ELISA板的每个孔中加入100微升稀释后的抗原。将板在4摄氏度下孵育过夜。孵育结束后，用每孔300微升的PBST洗涤板。

每孔加入 300 微升封闭液，在 37 摄氏度下封闭 2 小时。然后，将各实验组小鼠血清 3 微升用 PBST 稀释 100 倍（即加入 297 微升 PBST），涡旋振荡混匀。每孔加入 100 微升稀释后的血清样本至包被的 ELISA 板中。同样，将阳性与阴性对照血清用 PBST 稀释 100 倍：分别取 4 微升阳性或阴性对照血清加入 396 微升 PBST 中，涡旋振荡混匀。

进行双倍稀释时，将200微升先前稀释过的实验血清加入已包被的ELISA板的第一行孔中。然后，除第一行和第12行外，向所有孔中加入100微升PBST。接着，将移液器调整至100微升，从第一行取100微升血清转移至含有PBST的第二行孔中。

使用移液枪将第二行中的内容混合10次。同样地，将血清进行1:2的连续稀释，直至第11行。完成后，从第11行中弃去100微升液体。

根据样本模板，向第12行各对应孔中分别加入100 µL稀释后的阴性血清和阳性血清。用塑料封膜密封ELISA板，于37 °C孵育1小时。同时，用PBST将二抗（抗小鼠IgG HRP）稀释10,000倍。孵育1小时后，每孔加入300 µL PBST洗涤，以去除未结合的抗体。然后向每孔加入100 µL稀释后的二抗，于37 °C继续孵育40分钟。

每孔加入 300 微升 PBST 洗涤平板。然后每孔加入 100 微升 TMB 显色液。将平板置于 37 摄氏度、避光条件下反应 10 分钟。随后，每孔加入 50 微升 2 摩尔硫酸立即终止反应。在终止反应后 15 分钟内，使用酶标仪在 450 纳米处检测吸光度（OD 值）。