0 次观看 • 3:34 分钟 • July 8th, 2025
从感染病毒的哺乳动物细胞开始，该细胞可产生多种半胱天冬酶，包括半胱天冬酶-3。
向对照孔中加入生长培养基，向实验孔中加入添加了caspase-3抑制剂的培养基。
在对照孔中，caspase-3 识别并降解对病毒增殖至关重要的病毒核蛋白和宿主蛋白。
在检测孔中，抑制剂进入细胞，抑制caspase-3活性并防止蛋白质降解。
从培养板上解离细胞。加入裂解试剂并加热以诱导细胞裂解，释放胞内蛋白。
将两种样品加入SDS-聚丙烯酰胺凝胶中，通过电泳根据分子大小分离蛋白质。
电泳结束后，将凝胶转移至印迹膜上。
使用针对病毒核蛋白和宿主蛋白的一抗处理膜。
洗涤后加入与一抗结合的荧光素标记二抗，产生荧光条带。
检测样本中较高的荧光信号表明，与对照组相比，caspase-3 介导的病毒蛋白和宿主蛋白的切割作用降低。
首先，在12孔细胞培养板中接种MDCK或A549细胞，于37摄氏度、5%二氧化碳气氛条件下培养过夜。次日，移除细胞中的旧培养基，用1毫升无血清MEM培养基将每孔细胞洗涤两次。
然后通过加入400微升甲型流感病毒接种物感染细胞，并将培养板置于37°C孵育1小时。孵育结束后，吸除病毒接种物，并用MEM洗涤细胞。每孔加入1毫升无血清MEM，按照前一步所示条件继续孵育细胞。
24小时后，用1毫升注射器活塞刮取细胞，转移至1.5毫升离心管中。在室温下以12,000 g 离心2分钟，收集上清液。用250微升磷酸盐缓冲液洗涤细胞沉淀，然后离心。弃去上清液，加入100微升细胞裂解缓冲液，涡旋混匀。
将离心管在 98 摄氏度下加热 10 分钟，以彻底裂解细胞。随后，通过标准 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离未感染和感染样品中的等量蛋白质。电泳完成后，将蛋白质凝胶转移至硝酸纤维素膜或 PVDF 膜，并进行蛋白质印迹分析。比较对照处理和抑制剂处理的感染样品泳道中的蛋白质水平。