一种用于检测荧光抗生素探针在细菌细胞中积累的测定方法

取含有细菌样品的测定管。

在测试样品中，加入抑制剂分子以阻断细菌的抗生素外排泵。

离心并弃去上清液。

加入可进入细菌细胞的荧光素标记抗生素探针。

在对照样品中，外排泵将探针排出到细胞外环境中。

在抑制剂处理的样本中，被抑制的外排泵无法排出探针，导致探针在细胞内积聚。

离心样品。弃去含有细胞外探针的上清液。

加入裂解缓冲液，随后加入溶菌酶以削弱细菌细胞壁。

进行冻融循环、超声处理和高温暴露以裂解细胞。

离心。将上清液转移至滤膜。

洗涤并收集含有探针的滤液。

测定滤液的荧光强度。

经抑制剂处理的细菌样品中荧光强度升高，表明外排功能丧失，导致探针在细胞内蓄积。

进行探针累积分析时，将菌种的甘油保存菌株划线接种于LB琼脂平板上，在37摄氏度下培养过夜。次日早晨，从平板上挑取单个菌落，接种于LB液体培养基中，于37摄氏度下过夜培养。次日早晨，将过夜培养物用新鲜培养基稀释约50倍。

当菌液达到对数中期时，通过离心收集菌体，并弃去上清液。将细菌重悬于 1 毫升 PBS 中，再次离心。弃去上清液，将洗涤后的菌体沉淀重悬于 PBS 中，调节其在 600 纳米处的光密度至 2。

向1毫升细菌中加入10.1微升浓度为10毫摩尔的CCCP PBS溶液，在37摄氏度下孵育细菌10分钟。孵育结束后，通过离心收集细菌，并将菌体沉淀重悬于1毫升含10至100微摩尔荧光标记抗生素的PBS溶液中。

在37摄氏度孵育30分钟后，用1毫升冷PBS洗涤细胞，离心洗涤4次。洗涤后，加入180微升裂解缓冲液和70微升溶菌酶裂解细菌。

在37摄氏度下孵育30分钟后，将细菌在-78摄氏度下冷冻5分钟和34摄氏度下融化15分钟，反复冻融三次。最后一次冻融循环结束后，对样品超声处理20分钟，随后在65摄氏度下孵育30分钟。

孵育结束后，通过离心收集裂解样品，并将管内液体通过一个10千道尔顿的滤膜进行过滤。每次用100 µL水洗涤滤膜，共洗涤四次，并将每次洗涤液分别分装至黑色平底96孔板的各个独立孔中。然后使用酶标仪，在与所用荧光染料相匹配的激发和发射波长下测定荧光强度。