检测组蛋白修饰在植物叶片

一个可靠的和有用的方法来检测特定的植物基因组蛋白修饰的描述。该方法结合了染色质免疫沉淀（ChIP）和实时定量PCR。它允许在不同的生理过程作用，对特定的基因组蛋白修饰的检测。

以下方法可对所选植物基因上的特异性染色质修饰进行可靠、灵敏的检测。首先将修饰的组蛋白和 DNA 与甲醛交联。然后提取并超声处理染色质，以促进修饰特异性抗体的免疫沉淀。

最后，通过组蛋白 DNA 复合物的渣滓连接和基因特异性实时定量 PCR 分析 ChIP 反应。在植物中，这种方法可以提供分子见解，例如与迷宫中的 C 4 光合作用和拟南芥中的全身免疫相关的特异性组蛋白修饰。与 Mars 光谱法等现有方法相比，染色质免疫沉淀的主要优势在于，该技术允许检测植物基因组中选定序列上的组蛋白修饰。

通常，刚接触这种方法的人会很挣扎，因为该协议需要几个步骤，其正确性能是程序成功的关键。在本视频中，我们使用 ChIP 分析来深入了解模式植物拟南芥 ANA 中基因表达的失调，演示该程序的博士生 mic yakovich 对于每个样品，首先收获两克拟南芥叶和一个 50 毫升塑料管。用交联缓冲液填充 40 毫升标记，并将定制的过滤海绵放在缓冲表面的正上方，以确保叶子保持浸泡状态。

现在，将样品放入真空干燥液中，并加入滤液 10 分钟。为了终止交联反应，加入 2.5 毫升 2 摩尔甘氨酸，倒置混合。然后再次渗透 5 分钟，继续吸尘，再渗透 5 分钟。

然后在筛子上收获叶子时丢弃液体。在塑料烧杯中用一升水清洗叶子两次后，用纸巾彻底擦干叶子，将叶子收集到新的塑料管中，并在液氮中冷冻。将样品储存在零下 80 摄氏度，直到染色质分离。

使用液氮冷却的研钵和研杵，将冷冻样品研磨成细粉。将粉末转移到 50 毫升塑料管中。将粉末悬浮在 30 毫升 1 号提取缓冲液中，并在 4 摄氏度下在高架摇床上孵育 15 分钟。

将悬浮液穿过四层镜布，放入新的 50 毫升塑料管中。离心后，丢弃 SUP natin。接下来，使用画笔将沉淀重悬于 50 微升的 2 号提取缓冲液中，然后再加入 950 微升的提取缓冲液。

第二步，将悬浮液转移到 1.5 毫升微量离心管中，离心 10 分钟。同时，准备两毫升含有 1.5 毫升提取缓冲液的微量离心管。第三。

接下来，弃去上清液，逐渐将沉淀悬浮在 300 μL 提取缓冲液中。第三。首先，添加少量缓冲液。

第三，用画笔悬浮颗粒，然后添加剩余的缓冲液。现在小心地将样品分层在准备好的 1.5 毫升提取缓冲液管的顶部。第三，确保两相在 4 摄氏度下以 16， 000 倍 G 混合离心样品一小时。

丢弃 sup natin，用油漆刷将染色质沉淀悬浮在 300 微升超声处理缓冲液中，将染色质超声处理成约 400 个碱基对的 DNA 大小。超声处理时，确保染色质不会加热到大约 30 摄氏度以上。为了保护热敏联，将超声样品离心以沉淀未分离的材料，并将上清液收获到两个含有蛋白质琼脂糖和抗体结合缓冲液的微量离心管中。

加入 200 μL 样品染色质制备物。将试管在高架摇床上孵育 1 小时。离心后，收获样品上清液并分装 30 μL 蛋白质。

A 使用新鲜的 1.5 毫升试管测定输入材料的染色质浓度。保留 40 微升超声处理的染色质。然后将 400 微升超声处理的染色质悬液添加到 30 微升蛋白质 aros 中，并加入适量的修饰特异性抗体，在 4 摄氏度的顶置摇床上孵育过夜。

以 440 次 G 的浓度分化 2 分钟收获珠子，去除上清液，并在高架摇床上用 900 μL 的相应缓冲液连续洗涤珠子沉淀 10 分钟。最后一次洗涤后，完全去除任何残留的缓冲液。为了从组蛋白中分离 DNA，向磁珠中加入 400 μL D 交联缓冲液，并将之前保留的 40 μL 输入样品涡旋离心样品 5 分钟，并在 65 摄氏度下孵育过夜。

现在，使用市售 DNA 纯化试剂盒纯化 DNA，并进行常规基因座特异性实时定量 R-T-P-C-R。在这个例子中，拟南芥 ANA PR 双防御基因的表达是由 Benzo Diaz ole 诱导的，Benzo Diaz ole 是植物激素水杨酸的合成类似物。结果表明，PR 2 表达的激活与 PR 2 启动子上组蛋白 H 3 和 H four 上赖氨酸残基乙酰化的增加有关。

在尝试执行此程序时，请务必记住，向叶粉中添加提取缓冲液 1 会导致封闭的 fcon 管中过压。请记得偶尔打开管子。另外，请记住，在添加下一个缓冲液之前，不要在悬浮沉淀后去除画笔。

看完这个视频后，你应该对如何确定组蛋白修饰和形成基于醛的 DNA 和组蛋白交联、染色质免疫沉淀的分离和基因座特异性 DNA 定量的普通杠杆有一个很好的了解，以回答关于染色质及其修饰在植物生物学不同领域中的作用的关键问题。