Name: 检测组蛋白修饰在植物叶片 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: 学习使用染色质免疫沉淀结合实时定量PCR检测拟南芥叶片组蛋白修饰的方法。该技术可揭示植物基因调控的分子机制，为研究光合作用及免疫反应等生理过程提供重要工具。

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<p class="jove_content">本工作由德国科学基金会（DFG）以及德国联邦政府与州政府的卓越计划资助。</p>


<p class="jove_title">1. 植物材料的交联</p>
<ol>
 <li>在50 mL塑料管中采集1-2 g拟南芥叶片（莲座直径6至10 cm），并加入交联缓冲液至40 mL。</li>
 <li>确保叶片完全浸没于缓冲液中，例如在液面处塞入一块定制的滤膜海绵。然后将管子放入真空干燥器中。</li>
 <li>抽真空浸润10分钟。每管加入2.5 mL 2 M甘氨酸以终止交联反应，并轻轻倒置管子使甘氨酸均匀分布。</li>
 <li>再次抽真空浸润5分钟，随后倒掉液体，并用筛网收集叶片。</li>
 <li>将叶片在1 L烧杯中用去离子水清洗两次，然后用纸巾彻底吸干水分。</li>
 <li>将叶片转移至新的塑料管中，液氮速冻后于-80°C保存，直至进行染色质分离。</li>
</ol>
<p class="jove_title">2. 染色质的分离</p>
<ol>
 <li>将叶片与预冷至液氮温度的研钵和研杵一起研磨，直至使用。</li>
 <li>将粉末转移至一个50 mL塑料管中，并加入30 mL提取缓冲液#1悬浮。</li>
 <li>在4°C下，于 overhead 摇床上孵育15分钟。</li>
 <li>用四层Miracloth滤布将悬浮液过滤至一个新的50 mL塑料管中。</li>
 <li>在4°C下，以2,800 × g离心20分钟。</li>
 <li>弃去上清液，用毛笔将沉淀物悬浮于1 mL提取缓冲液#2中。先加入少量缓冲液#2，用毛笔将沉淀悬浮，再加入剩余缓冲液。</li>
 <li>将悬浮液转移至1.5 mL微量离心管中，在4°C下以12,000 × g离心10分钟。</li>
 <li>同时，准备含有1.5 mL提取缓冲液#3的2 mL微量离心管。</li>
 <li>弃去上一步离心后的上清液（步骤2.7），将沉淀物用毛笔悬浮于300 μL提取缓冲液#3中。先加入少量缓冲液#3，用毛笔悬浮沉淀，再加入剩余缓冲液。</li>
 <li>小心地将步骤2.9中悬浮的沉淀物加至步骤2.8中已准备好的1.5 mL提取缓冲液#3上方。确保两相不混合。在4°C下以16,000 × g离心1小时。</li>
 <li>弃去上清液，用毛笔将染色质沉淀物悬浮于300 μL超声破碎缓冲液中。</li>
 <li>使用超声探头或超声水浴对染色质进行超声处理，使DNA片段化至约400 bp。超声过程中需确保染色质温度不超过约30 °C，以保护热敏感的交联结构。超声时间需根据实验确定，因不同超声设备间差异显著。以下提供两种不同设备的参考设置：</li>
</ol>
<p class="jove_content">使用Bandelin品牌的超声探头进行超声处理时，将染色质置于0.6 mL离心管中，以25%功率、周期=50的设置进行5次超声，每次20个脉冲。每次超声后需对样品进行冷却。<sup>th</sup> 在冰浴中爆裂。</p>
<p class="jove_content">使用 Diagenode Bioruptor 超声波破碎仪进行超声处理时，将水和冰加入超声波浴槽中，于1.5 mL离心管中以“高”档设置超声处理10次，每次30秒。每次超声30秒后，将样品冷却30秒。</p>
<ol start="13"><li>在4°C条件下，以16,000g离心超声处理后的样品5分钟，以沉淀未溶解的物质。上清液可直接用于免疫沉淀。或者，样品可用液氮速冻，并在-80°C保存，直至后续使用。</li></ol>
<p class="jove_title">3. 免疫沉淀</p>
<ol>
 <li>准备含有 40μL 蛋白A琼脂糖和 1.8mL 抗体结合缓冲液的 2-mL 微量离心管。加入 200μL 染色质样品（步骤 2.13）。</li>
 <li>在振荡器上 4°C 孵育 1 小时。</li>
 <li>弃去蛋白A琼脂糖珠，取上清液用于免疫沉淀。</li>
 <li>取出 40μL 等分试样以测定染色质浓度（“输入”样品）。</li>
 <li>向 400μL 超声处理后的染色质悬浮液中加入 30μL 蛋白A琼脂糖以及下表“特定试剂与设备”中指定量的修饰特异性抗体。</li>
 <li>在 4°C 振荡器上孵育 2.5 小时或过夜。</li>
 <li>在 440 × g 条件下离心 2 分钟，沉淀珠子。</li>
 <li>依次用 900μL 各种洗涤缓冲液（见下表列表）洗涤珠子沉淀。每种缓冲液均需在 4°C 振荡器上孵育 10 分钟，然后在 440 × g 条件下离心 2 分钟，弃去上清液，再加入下一种缓冲液。
<ol>
<li>低盐洗涤缓冲液</li>
<li>高盐洗涤缓冲液</li>
<li>LiCl 洗涤缓冲液</li>
<li>TE 洗涤缓冲液</li>
</ol></li>
 <li>最后一次洗涤后，彻底去除残留的缓冲液。</li>
</ol>
<p class="jove_title">4. 组蛋白与DNA的去交联及沉淀DNA的纯化</p>
<ol>
 <li>向琼脂糖沉淀和第3.4步中保留的40μl“输入”样品中各加入100μL去交联缓冲液，在涡旋振荡器上混匀5分钟，离心样品后于65°C孵育过夜。</li>
 <li>使用商品化的DNA纯化试剂盒或PCR产物纯化试剂盒纯化DNA。</li>
 <li>通常取最终洗脱液1:5稀释后的5μl即可用于常规的位点特异性实时定量RT-PCR（RT-qPCR）分析。</li>
</ol>
<p class="jove_title">5. 缓冲液配方表</p>
<table border="1">
 <tbody>
  <tr>
   <td colspan="2"><strong>交联缓冲液</strong></td>
  </tr>
  <tr>
   <td>丁酸钠</td>
   <td>10mM</td>
  </tr>
  <tr>
   <td>蔗糖</td>
   <td>400mM</td>
  </tr>
  <tr>
   <td>Tris-HCl, pH 8.0</td>
   <td>10mM</td>
  </tr>
  <tr>
   <td>β-巯基乙醇</td>
   <td>5mM</td>
  </tr>
  <tr>
   <td>甲醛</td>
   <td>3% (v/v) </td>
  </tr>
 </tbody>
</table>
<table border="1">
 <tbody>
  <tr>
   <td colspan="2"><strong>提取缓冲液 #1</strong></td>
  </tr>
  <tr>
   <td>丁酸钠</td>
   <td>10mM</td>
  </tr>
  <tr>
   <td>蔗糖</td>
   <td>400mM</td>
  </tr>
  <tr>
   <td>Tris-HCl, pH 8.0</td>
   <td>10mM</td>
  </tr>
  <tr>
   <td>β-巯基乙醇</td>
   <td>5mM</td>
  </tr>
  <tr>
   <td>Complete蛋白酶抑制剂</td>
   <td>1x</td>
  </tr>
 </tbody>
</table>
<table border="1">
 <tbody>
  <tr>
   <td colspan="2"><strong>提取缓冲液 #2</strong></td>
  </tr>
  <tr>
   <td>丁酸钠</td>
   <td>10mM</td>
  </tr>
  <tr>
   <td>蔗糖</td>
   <td>250mM</td>
  </tr>
  <tr>
   <td>Tris-HCl, pH 8.0</td>
   <td>10mM</td>
  </tr>
  <tr>
   <td>β-巯基乙醇</td>
   <td>5mM</td>
  </tr>
  <tr>
   <td>MgCl<sub>2</sub></td>
   <td>10mM</td>
  </tr>
  <tr>
   <td>Triton X-100</td>
   <td>1% (w/v)</td>
  </tr>
  <tr>
   <td>Complete蛋白酶抑制剂</td>
   <td>1x</td>
  </tr>
 </tbody>
</table>
<table border="1">
 <tbody>
  <tr>
   <td colspan="2"><strong>提取缓冲液 #3</strong></td>
  </tr>
  <tr>
   <td>Sodium butyrate</td>
   <td>10mM</td>
  </tr>
  <tr>
   <td>Sucrose</td>
   <td>1.7M</td>
  </tr>
  <tr>
   <td>Tris-HCl, pH 8.0</td>
   <td>10mM</td>
  </tr>
  <tr>
   <td>β-Mercaptoethanol</td>
   <td>5mM</td>
  </tr>
  <tr>
   <td>MgCl<sub>2</sub></td>
   <td>2mM</td>
  </tr>
  <tr>
   <td>Triton X-100</td>
   <td>0.15% (w/v)</td>
  </tr>
  <tr>
   <td>Complete Protease Inhibitor</td>
   <td>1x</td>
  </tr>
 </tbody>
</table>
<table border="1">
 <tbody>
  <tr>
   <td colspan="2"><strong>超声缓冲液</strong></td>
  </tr>
  <tr>
   <td>Tris-HCl, pH 8.0</td>
   <td>25mM</td>
  </tr>
  <tr>
   <td>EDTA-NaOH, pH 8.0</td>
   <td>5mM</td>
  </tr>
  <tr>
   <td>SDS</td>
   <td>0.5% (w/v)</td>
  </tr>
  <tr>
   <td>Complete蛋白酶抑制剂</td>
   <td>1x</td>
  </tr>
 </tbody>
</table>
<table border="1">
 <tbody>
  <tr>
   <td colspan="2"><strong>抗体结合缓冲液</strong></td>
  </tr>
  <tr>
   <td>Tris-HCl, pH 8.0</td>
   <td>50mM</td>
  </tr>
  <tr>
   <td>EDTA-NaOH, pH 8.0</td>
   <td>1mM  </td>
  </tr>
  <tr>
   <td>NaCl</td>
   <td>150mM</td>
  </tr>
  <tr>
   <td>Triton X-100</td>
   <td>0.1% (w/v)</td>
  </tr>
 </tbody>
</table>
<table border="1">
 <tbody>
  <tr>
   <td colspan="2"><strong>低盐洗涤缓冲液</strong></td>
  </tr>
  <tr>
   <td>NaCl</td>
   <td>150mM</td>
  </tr>
  <tr>
   <td>SDS</td>
   <td>0.1% (w/v)</td>
  </tr>
  <tr>
   <td>Triton X-100</td>
   <td>1% (w/v)</td>
  </tr>
  <tr>
   <td>EDTA-NaOH, pH 8.0</td>
   <td>2mM</td>
  </tr>
  <tr>
   <td>Tris-HCl, pH 8.0</td>
   <td>20mM</td>
  </tr>
 </tbody>
</table>
<table border="1">
 <tbody>
  <tr>
   <td colspan="2"><strong>高盐洗涤缓冲液</strong></td>
  </tr>
  <tr>
   <td>NaCl</td>
   <td>500mM</td>
  </tr>
  <tr>
   <td>SDS</td>
   <td>0.1% (w/v)</td>
  </tr>
  <tr>
   <td>Triton X-100</td>
   <td>1% (w/v)</td>
  </tr>
  <tr>
   <td>EDTA-NaOH, pH 8.0</td>
   <td>2mM</td>
  </tr>
  <tr>
   <td>Tris-HCl, pH 8.0</td>
   <td>20mM</td>
  </tr>
 </tbody>
</table>
<table border="1">
 <tbody>
  <tr>
   <td colspan="2"><strong>LiCl 洗涤缓冲液</strong></td>
  </tr>
  <tr>
   <td>氯化锂</td>
   <td>250mM</td>
  </tr>
  <tr>
   <td>Nonidet-P40</td>
   <td>1% (v/v)</td>
  </tr>
  <tr>
   <td>脱氧胆酸钠</td>
   <td>1% (w/v)</td>
  </tr>
  <tr>
   <td>EDTA-NaOH, pH 8.0</td>
   <td>1mM</td>
  </tr>
  <tr>
   <td>Tris-HCl, pH 8.0</td>
   <td>20mM</td>
  </tr>
 </tbody>
</table>
<table border="1">
 <tbody>
  <tr>
   <td><strong>TE 洗涤缓冲液  </strong></td>
  </tr>
  <tr>
   <td>EDTA-NaOH, pH 8.0</td>
   <td>10mM</td>
  </tr>
  <tr>
   <td>Tris-HCl, pH 8.0</td>
   <td>1mM</td>
  </tr>
 </tbody>
</table>
<table border="1">
 <tbody>
  <tr>
   <td><strong>解交联缓冲液</strong></td>
  </tr>
  <tr>
   <td>Tris-HCl, pH 6.8</td>
   <td>62.5mM</td>
  </tr>
  <tr>
   <td>NaCl</td>
   <td>200mM</td>
  </tr>
  <tr>
   <td>SDS</td>
   <td>2% (w/v)</td>
  </tr>
  <tr>
   <td>DTT</td>
   <td>10mM</td>
  </tr>
 </tbody>
</table>
<p class="jove_title">6. 代表性结果：</p>
<p class="jove_content">表达 <em>拟南芥 PR2</em> 编码具有抗菌活性的β-1,3-葡聚糖酶的防御基因<sup>12</sup>，由苯并噻二唑（BTH）诱导，BTH 是植物激素水杨酸的一种合成类似物<sup>3</sup>. <strong>图1</strong> 表明激活 <em>PR2</em> 表达与组蛋白H3和H4上赖氨酸残基乙酰化水平的升高相关 <em>PR2</em> 启动子。由于核小体密度在基因激活过程中降低<sup>13</sup>组蛋白乙酰化水平通过组蛋白3不变区域抗体的信号进行归一化处理。</p>
<p class="jove_content"><img src="/files/ftp_upload/3096/3096fig1.jpg" alt="柱状图显示经BTH处理后组蛋白乙酰化（H4K5ac-H3K9ac）的倍数增加。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"><br><strong>图1 BTH诱导拟南芥中<em>PR2</em>启动子区域的组蛋白乙酰化</strong>。植物用100μM BTH或可湿性粉剂对照处理。处理72小时后，收集叶片并分离染色质。使用特异性识别乙酰化位点的抗体进行免疫沉淀后获得的信号，经抗组蛋白H3恒定结构域抗体免疫沉淀信号归一化。沉淀的染色质通过RT-qPCR定量。数据已标准化为未用BTH处理时的组蛋白修饰水平。</p>

<ol><li>Eberharter, A., Becker, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+acetylation%3A+a+switch+between+repressive+and+permissive+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+rep%22%5BJournal%5D)">Histone acetylation: a switch between repressive and permissive chromatin.</a> <em>EMBO rep</em>. <strong>3</strong>, 224-229 (2002).</li>
<li>Ruthenburg, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylation+of+lysine+4+on+histone+H3%3A+intricacy+of+writing+and+reading+a+single+epigenetic%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Methylation of lysine 4 on histone H3: intricacy of writing and reading a single epigenetic.</a> <strong>25</strong>, 15-30 (2007).</li>
<li>Jaskiewicz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+modification+acts+as+a+memory+for+systemic+acquired+resistance+in+the+plant+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+rep%22%5BJournal%5D)">Chromatin modification acts as a memory for systemic acquired resistance in the plant stress response.</a> <em>EMBO rep</em>. <strong>12</strong>, 50-55 (2011).</li>
<li>Ng, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ordered+histone+modifications+are+associated+with+transcriptional+poising+and+activation+of+the+phaseolin+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Ordered histone modifications are associated with transcriptional poising and activation of the phaseolin promoter.</a> <em>Plant Cell</em>. <strong>18</strong>, 119-132 (2006).</li>
<li>Offermann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illumination+is+necessary+and+sufficient+to+induce+histone+acetylation+independent+of+transcriptional+activity+at+the+C4-specific+phosphoenolpyruvate+carboxylase+promoter+in+maize%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Illumination is necessary and sufficient to induce histone acetylation independent of transcriptional activity at the C4-specific phosphoenolpyruvate carboxylase promoter in maize.</a> <em>Plant Physiol</em>. <strong>141</strong>, 1078-1088 (2006).</li>
<li>Deng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+the+histone+acetyltransferase+AtHAC1+in+the+regulation+of+flowering+time+via+repression+of+FLOWERING+LOCUS+C+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Involvement of the histone acetyltransferase AtHAC1 in the regulation of flowering time via repression of FLOWERING LOCUS C in Arabidopsis.</a> <em>Plant Physiol</em>. <strong>143</strong>, 1660-1668 (2007).</li>
<li>Benhamed, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+GCN5%2C+HD1%2C+and+TAF1%2FHAF2+interact+to+regulate+histone+acetylation+required+for+light-responsive+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis GCN5, HD1, and TAF1/HAF2 interact to regulate histone acetylation required for light-responsive gene expression.</a> <em>Plant Cell</em>. <strong>18</strong>, 2893-2903 (2006).</li>
<li>Bowler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+techniques+for+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Chromatin techniques for plant cells.</a> <em>Plant Journal</em>. <strong>39</strong>, 776-789 (2004).</li>
<li>Orlando, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+chromosomal+proteins+in+vivo+by+formaldehyde+decrosslinked-chromatin+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">Mapping chromosomal proteins in vivo by formaldehyde decrosslinked-chromatin immunoprecipitation.</a> <em>Trends Biochem. Sci</em>. <strong>25</strong>, 99-104 (2000).</li>
<li>Haring, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation%3A+optimization%2C+quantitative+analysis+and+data+normalization%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Meth%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization.</a> <em>Plant Meth</em>. <strong>3</strong>, 11-11 (2007).</li>
<li>Danker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+information+but+not+promoter+activity+controls+the+methylation+state+of+histone+H3+lysine+4+on+two+photosynthetic+genes+in+maize%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Developmental information but not promoter activity controls the methylation state of histone H3 lysine 4 on two photosynthetic genes in maize.</a> <em>Plant J</em>. <strong>53</strong>, 465-474 (2008).</li>
<li>Uknes, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acquired+resistance+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Acquired resistance in Arabidopsis.</a> <em>Plant Cell</em>. <strong>4</strong>, 645-656 (1992).</li>
<li>Workman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleosome+displacement+in+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Develop%22%5BJournal%5D)">Nucleosome displacement in transcription.</a> <em>Genes Develop</em>. <strong>20</strong>, 2009-2017 (2006).</li>
</ol>

<p class="jove_content">无利益冲突声明。</p>

<p class="jove_content">该实验方案中最关键的步骤包括DNA与组蛋白的交联、叶片材料的类型和用量、材料的研磨以及染色质的超声处理。有关这些问题的更详细讨论，请参见参考文献9和10。</p>
<p class="jove_step">超声处理与交联：</p>
<p class="jove_content">超声处理过程中将染色质打断至约400 bp的片段至关重要。过度超声会破坏DNA和组蛋白，从而降解染色质；而超声不足则会留下较长的染色质片段。这些情况会影响实验的特异性，因为无法区分远离目标位点的组蛋白修饰与局部修饰。最佳的超声效率检测方法是：在超声处理前后分别收集20 μL染色质样品，解交联DNA与组蛋白，纯化DNA，并通过琼脂糖凝胶电泳测定剪切后DNA的长度。电泳前应在样品中加入RNase，因为在此纯化阶段，染色质样品中仍含有大量RNA，可能干扰片段化DNA的可视化。若未剪切染色质的DNA长度超过10 kbp，而剪切后染色质的DNA在凝胶上呈现约400 bp处信号最强的弥散条带，则该样品适用于染色质免疫沉淀实验。</p>
<p class="jove_content">我们通常使用3%（v/v）甲醛对完整叶片中的染色质进行交联，但在大多数情况下，1%（v/v）甲醛可能已足够。据我们的经验，较低浓度的甲醛可缩短后续超声处理时间，并降低PCR反应中的背景信号。然而，甲醛用量不足常常导致独立重复实验之间PCR信号的可重复性较低，这可能是由于低浓度下甲醛渗透叶片不充分所致。请务必频繁更换甲醛储备液，因为该化合物会随时间推移发生聚合。甲醛溶液仅在约一个月内保持稳定，甲醇稳定化几乎无法延长其有效期。建议在建立实验条件时测试不同的甲醛浓度。</p>
<p class="jove_step">植物材料用量及研磨：</p>
<p class="jove_content">使用大量缓冲液浸润少量叶片材料非常重要，以避免叶片相互粘连。叶片粘连通常会导致甲醛浸透不充分。此外，过多的植物材料会堵塞Miracloth纱布的孔隙。研磨效率在很大程度上取决于研钵和研杵是否匹配得当。我们通常在不额外添加液氮的情况下，使用经液氮预冷的研钵和研杵研磨三次，每次50秒，直至材料被研磨成细粉。</p>


<table><tbody><tr><td>蛋白A-琼脂糖</td><td>Roche Group</td><td>11 134 515 001</td><td>取决于抗体类别</td></tr><tr><td>蛋白G-琼脂糖</td><td>Roche Group</td><td>11 243 233 001</td><td>取决于抗体类别</td></tr><tr><td>抗高乙酰化H4抗体</td><td>EMD Millipore</td><td>06-946</td><td>我们使用了5&amp;#x03BC;L</td></tr><tr><td>抗乙酰化H4K5抗体</td><td>EMD Millipore</td><td>07-327</td><td>我们使用了5&amp;#x03BC;L</td></tr><tr><td>抗乙酰化H4K8抗体</td><td>EMD Millipore</td><td>07-328</td><td>我们使用了5&amp;#x03BC;L</td></tr><tr><td>抗乙酰化H4K12抗体</td><td>EMD Millipore</td><td>07-595</td><td>我们使用了5&amp;#x03BC;L</td></tr><tr><td>抗乙酰化H4K16抗体</td><td>EMD Millipore</td><td>07-329</td><td>我们使用了5&amp;#x03BC;L</td></tr><tr><td>抗乙酰化H4K18抗体</td><td>EMD Millipore</td><td>07-354</td><td>我们使用了1&amp;#x03BC;L</td></tr><tr><td>抗乙酰化H3K9抗体</td><td>EMD Millipore</td><td>07-352</td><td>我们使用了5&amp;#x03BC;L</td></tr><tr><td>抗乙酰化H3K14抗体</td><td>EMD Millipore</td><td>07-353</td><td>我们使用了1&amp;#x03BC;L</td></tr><tr><td>抗三甲基化H3K4抗体</td><td>Diagenode</td><td>pAB-003-50</td><td>我们使用了5&amp;#x03BC;L</td></tr><tr><td>抗二甲基化H3K4抗体</td><td>EMD Millipore</td><td>07-030</td><td>我们使用了5&amp;#x03BC;L</td></tr><tr><td>抗单甲基化H3K4抗体</td><td>Abcam</td><td>ab8895</td><td>2.5–10&amp;#x03BC;L</td></tr><tr><td>抗H3抗体</td><td>Abcam</td><td>ab1791</td><td>我们使用了1&amp;#x03BC;L以检测组蛋白密度</td></tr><tr><td>Bioruptor</td><td>Diagenode</td><td>UCD-200 TO</td><td></td></tr><tr><td>Sonotrode MS72</td><td>Bandelin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Miracloth</td><td>Calbiochem</td><td>475855</td><td></td></tr><tr><td>完全蛋白酶抑制剂</td><td>Roche Group</td><td>11836145001</td><td></td></tr></tbody></table>

植物叶片中组蛋白修饰的检测

Detection of Histone Modifications in Plant Leaves

<p class="jove_content">染色质结构对真核生物基因表达的调控具有重要意义。在此过程中，染色质重塑、DNA甲基化以及组蛋白H3和H4氨基末端尾部的共价修饰发挥着关键作用<sup>1-2</sup>。H3和H4组蛋白的修饰包括赖氨酸和精氨酸的甲基化、赖氨酸的乙酰化以及丝氨酸残基的磷酸化<sup>1-2</sup>。这些修饰与基因的激活、抑制或处于一种“启动”状态相关，后者可在感知到适当信号（如微生物相关分子模式、光、激素等）后支持基因表达更快速、更强烈地被激活<sup>3-7</sup>。</p>
<p class="jove_content">本文介绍一种在选定植物基因上可靠且灵敏地检测特定染色质修饰的方法。该技术基于使用甲醛对（修饰的）组蛋白与DNA进行交联<sup>8,9</sup>，随后提取染色质并进行超声处理，利用针对特定修饰的抗体进行染色质免疫沉淀（ChIP）<sup>9,10</sup>，解交联组蛋白-DNA复合物，最后通过基因特异性的实时定量PCR进行检测。该方法已被证实可用于检测与玉米中C<sub>4</sub>光合作用相关的特定组蛋白修饰<sup>5,11</sup>，以及拟南芥中系统性免疫相关的组蛋白修饰<sup>3</sup>。</p>


<p class="jove_content">本文介绍了一种用于检测特定植物基因组蛋白修饰的可靠且实用的方法。该方法结合了染色质免疫沉淀（ChIP）与实时定量PCR技术，能够检测在多种生理过程中发挥功能的特定基因上的组蛋白修饰。</p>

染色质结构对真核生物基因表达的调控具有重要意义。在此过程中，染色质重塑、DNA甲基化和共价修饰等机制发挥着关键作用。

<p>以下方法可对选定的植物基因上的特定染色质修饰进行可靠且灵敏的检测。首先用甲醛交联修饰的组蛋白与DNA，然后提取染色质并进行超声处理，以利于使用特异性识别该修饰的抗体进行免疫沉淀。</p><p>最后通过组蛋白-DNA复合物的沉淀交联及基因特异性的实时定量PCR分析芯片反应。在植物中，该方法可提供分子层面的见解，例如与玉米中C4光合作用以及拟南芥系统性免疫相关的特异性组蛋白修饰。染色质免疫沉淀技术相较于现有方法（如质谱法）的主要优势在于，该技术能够检测植物基因组中选定序列上的组蛋白修饰。</p><p>通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为该实验流程包含若干关键步骤，其操作的准确性对实验成功至关重要。在本视频中，我们采用染色质免疫共沉淀芯片分析（chip analysis），揭示模式植物拟南芥（Arabidopsis ANA）中基因表达的失调情况，以演示该实验操作。本实验由博士研究生 Mic Yakovich 完成。每个样品起始步骤为：采集两克拟南芥叶片，置于一个 50 毫升塑料管中，加入交联缓冲液至 40 毫升刻度线处，并在缓冲液液面之上放置一块定制的滤膜海绵，以确保叶片完全浸没于液体中。</p><p>现在，将样品置于真空干燥器中脱水并抽滤10分钟。为终止交联反应，加入2.5毫升2摩尔的甘氨酸，并通过倒置混匀。然后再次抽滤5分钟，继续维持真空，再抽滤5分钟。</p><p>然后在筛子上收集叶片并弃去液体。用一升水在塑料烧杯中将叶片清洗两次后，用纸巾彻底擦干叶片，将叶片收集到新的塑料管中，并在液氮中速冻。在进行染色质分离前，将样品保存在负80摄氏度条件下。</p><p>使用液氮冷却的研钵和研杵将冷冻样品研磨成细粉。将粉末转移至一个50毫升的塑料管中。加入30毫升提取缓冲液一，悬浮粉末，并在4摄氏度下于摇床上孵育15分钟。</p><p>将悬液通过四层镜面布过滤至一个新的50毫升塑料离心管中。离心后，弃去上清液。接着，用毛笔将沉淀重悬于50微升提取缓冲液二中，然后加入另外950微升提取缓冲液。</p><p>第二步，将悬液转移至1.5毫升微量离心管中，离心10分钟。同时，准备含有1.5毫升提取缓冲液的2毫升微量离心管。第三步。</p><p>接着，弃去上清液，逐步将沉淀重悬于 300 µL 裂解缓冲液中。第三步。首先，加入少量缓冲液。</p><p>第三步，用画笔重悬沉淀，然后加入剩余的缓冲液。现在将样品小心地铺加到已准备好的离心管中，每管含1.5毫升提取缓冲液。第三步，确保两相不混合，于4°C、16,000 × g条件下离心样品一小时。</p><p>弃去上清液，用画笔将染色质沉淀重悬于 300 µL 超声缓冲液中，超声处理染色质至 DNA 片段大小约为 400 个碱基对。超声过程中，确保染色质温度不超过约 30 °C。为保护热敏感的交联结构，将超声处理后的样品离心以沉淀未溶解物质，并将上清液转移至含有蛋白琼脂糖和抗体结合缓冲液的 2 mL 微离心管中。</p><p>加入200微升样品染色质制备物。将离心管置于翻转摇床上孵育一小时。离心后，收集样品上清液，并分装30微升蛋白质。</p><p>取新鲜的1.5毫升离心管用于测定输入材料的染色质浓度。保留40微升超声处理后的染色质。然后将400微升超声处理后的染色质悬液加入含30微升蛋白珠和适量修饰特异性抗体的离心管中，于4摄氏度在旋转摇床上孵育过夜。</p><p>以440 × g离心两分钟收集珠粒。移除上清液，并在振荡器上用900 µL相应缓冲液对珠粒沉淀进行连续洗涤，每次10分钟。最后一次洗涤后，彻底移除残留缓冲液。为使DNA从组蛋白中游离，向珠粒中加入400 µL D裂解缓冲液，以及先前保留的40 µL输入样品，涡旋混匀5分钟，离心样品，并在65 °C孵育过夜。</p><p>现在，使用商品化的DNA纯化试剂盒纯化DNA，并进行常规的位点特异性实时定量逆转录PCR（R-T-P-C-R）。在此示例中，拟南芥ANA PR2防御基因的表达由苯并噻二唑（BTH）诱导，BTH是植物激素水杨酸的一种合成类似物。结果表明，PR2基因表达的激活与PR2启动子区域组蛋白H3和H4上赖氨酸残基乙酰化水平的升高相关。</p><p>进行此操作时，需要注意向叶片粉末中加入提取缓冲液一后，会导致封闭的fcon管内压力过高。请记得每隔一段时间打开一次管盖。此外，在加入下一种缓冲液之前，悬浮沉淀后切勿取出毛刷。</p><p>观看本视频后，您应能充分理解如何通过基于甲醛的 DNA 与组蛋白交联、染色质免疫沉淀以及位点特异性 DNA 定量，来确定组蛋白修饰和顺式作用元件，从而回答植物生物学不同领域中有关染色质及其修饰功能的关键问题。</p>

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

检测组蛋白修饰在植物叶片

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利用靶向切割与标签化技术对植物中H3K4me3修饰进行分析

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研究组蛋白修饰酶与转录因子之间的相互作用 <em>在体</em> 通过荧光共振能量转移

基于液相色谱、捕集离子淌度质谱和飞行时间质谱（LC-TIMS-ToF MS/MS）的分析工作流程，用于高置信度和高重复性的“自下而上”组蛋白修饰分析，并依据主要参数（保留时间 [RT]、碰撞截面 [CCS] 和精确质荷比...

使用液相色谱、捕获离子淌度谱和飞行时间质谱进行组蛋白修饰筛选

本方案描述了一种高通量方法，可用于同一样本中植物离子渗漏、过氧化物酶活性和胼胝质生成的评估。...

利用高通量方法评估叶片对微生物次级代谢产物的响应

学习使用染色质免疫沉淀结合实时定量PCR检测拟南芥叶片组蛋白修饰的方法。该技术可揭示植物基因调控的分子机制，为研究光合作用及免疫反应等生理过程提供重要工具。

植物叶片中组蛋白修饰的检测

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