一种培养小鼠海马神经元的技术

在缓冲液中取一只收获的小鼠仔鼠海马。

将海马体切成更小的碎片，并转移至锥形管中。

用缓冲液洗涤组织。待组织碎片沉降后，移除缓冲液。接着加入新鲜缓冲液和胰蛋白酶。

孵育过程中，胰蛋白酶（一种蛋白水解酶）会消化组织的细胞外基质，使海马神经元松散。

用缓冲液洗涤消化后的组织。

待组织碎片沉降后，移除缓冲液。加入新鲜缓冲液，并反复吹打组织，通过机械方法将其解离，获得单细胞悬液。

待未消化的组织沉淀后，将细胞悬液转移至含有培养基的培养板中，置于带有石蜡支撑的多聚-L-赖氨酸包被的盖玻片上。

细胞通过静电相互作用附着在聚-L-赖氨酸包被的表面。

现在，将带有神经元的盖玻片倒置放入含有皮质胶质细胞或非神经元细胞的培养皿中，培养基为无血清培养基。

在培养过程中，石蜡支撑物可防止神经元与胶质细胞直接接触，从而形成一种微环境，其中胶质细胞分泌的因子促进神经元的存活与成熟。

首先，在培养皿中使用 HBSS 培养基从出生后一天大的幼鼠中分离出六至八个海马体。用解剖剪将海马体剪成较小的组织块，然后将其从培养皿转移至一个 15 毫升离心管中。用 5 毫升 HBSS 培养基洗涤海马体两次，每次洗涤后弃去上清，最终将组织留置于 4.5 毫升 HBSS 培养基中。

将0.5毫升的2.5%胰蛋白酶加入4.5毫升HBSS中，在37°C水浴中孵育15分钟，每5分钟颠倒试管一次。消化充分的海马组织应变得黏稠并聚集成团。如有需要，可将消化时间延长5分钟。

用HBSS清洗海马组织，每次5分钟，共清洗三次。清洗后，加入2毫升HBSS，用巴斯德移液管将海马组织上下吹打15次。用火焰抛光的巴斯德移液管吹打组织10次，然后将试管静置5分钟，直至所有组织块沉至管底。对剩余的组织块重复吹打操作，直至大部分组织块消失。

然后，使用1毫升移液枪头轻轻将含有解离神经元的上清液转移至铺板培养皿中。直接加入预先孵育的铺板培养基中，并轻轻摇动培养板。接种后2至4小时，使用光学显微镜检查铺板培养皿，大多数神经元应已贴附于盖玻片上。

使用尖头镊子将盖玻片翻转至含有预处理神经元培养基的胶质细胞饲养层培养皿中，使蜡点面朝下。神经元可在胶质细胞饲养层培养皿中生长长达一个月。每隔七天，加入 1 毫升新鲜神经元培养基对神经元进行换液。