从冻存的胚胎神经元制备低密度原代神经元培养物

取一支含有冷冻保存的胚胎神经元的冻存管，放入加热模块中进行程序化解冻。

接下来，将解冻的神经元转移至离心管中，并逐滴加入神经基础培养基以平衡渗透压，防止细胞裂解。

这会形成一种神经元均匀分散的均质悬浮液。

将稀释后的神经细胞悬液接种至含神经基础培养基（添加营养物质和抗生素）的多孔板中，该多孔板预先经多聚-L-赖氨酸包被。

孵育，使带正电荷的聚-L-赖氨酸与神经元相互作用 通过 静电相互作用，促进其黏附。

向孔中加入新鲜的神经基础培养基。

在相同培养基中孵育细胞，并保持湿润环境以防止培养基蒸发。

胚胎神经元利用营养物质，通过发育出神经突起并形成初级神经元而生长。

神经基础培养基可维持原代神经元的生长，这些神经元分布较为稀疏，形成低密度的原代神经元培养体系，并建立神经元之间的连接。

首先，在96孔微孔板的每个孔中加入100微升的聚-L-赖氨酸。接着，在37摄氏度下将微孔板孵育过夜。孵育结束后，移除聚-L-赖氨酸溶液。用无菌水洗涤微孔板两次，再用不含添加剂的新鲜培养基洗涤一次。将微孔板置于干燥环境中。干燥后的微孔板可用包装材料包裹，并在4摄氏度下保存长达一个月。

开始细胞接种时，向包被好的培养板的每个孔中加入50微升培养基。在周边孔中加入200微升无菌水，并将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育1小时。

从液氮罐中取出神经元冻存管，放入37摄氏度的加热金属块中，使其内容物部分解冻。使用带有宽孔枪头的1毫升移液器，将冻存管中的内容物逐滴缓慢转移至无菌的50毫升离心管中。用1毫升室温培养基冲洗空的冻存管，然后将冲洗液转移至含有细胞悬液的50毫升离心管中。

接下来，将9毫升室温培养基逐滴加入50毫升离心管中，使总体积达到11毫升。使用血细胞计数板对细胞进行计数后，将细胞悬液转移至储液槽中。然后，使用带宽口吸头的多通道移液器，将细胞悬液以每孔1.0 × 10⁴ 个细胞的终浓度加入包被好的96孔板中。

将神经元在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育1至2小时。然后将培养基更换为100微升预热的培养基，并在相同条件下再次孵育。