利用多孔支架将人神经干细胞分化为三维培养

从一个含有可透性插件的多孔板开始，该插件内含具有三维多孔结构的聚苯乙烯支架。

加入乙醇以重新水化支架，然后用培养基洗涤。

加入含有细胞外基质蛋白层粘连蛋白（laminin）的培养基。孵育以使层粘连蛋白包被支架。

将人神经干细胞接种于含有生长因子的神经培养基中，并置于层粘连蛋白包被的支架上。

孵育以使干细胞迁移至多孔支架内，其中层粘连蛋白可促进细胞在支架上的黏附。

细胞利用该支架内的生长因子并在其中增殖。

添加不含生长因子的神经培养基，并定期更换耗尽的培养基以维持细胞活力。

缺乏生长因子会促进干细胞向神经前体细胞分化。

随着时间推移，这些前体细胞的神经突起逐渐伸长，支持多方向的细胞生长，并形成三维培养结构。

通过向 Alvetex 12 孔板的每个孔中加入 2 毫升用冲洗用水配制的 70% 乙醇，使支架水化。加液时应沿每孔孔壁加入，避免触碰支架。小心吸除 70% 乙醇，并立即用每孔 2 毫升的 DMEM F12 对支架洗涤一分钟。

重复洗涤步骤两次。最后一次洗涤后，小心吸除DMEM F12。通过向每个孔中加入含有2毫升层粘连蛋白的DMEM F12溶液来包被支架。将培养板置于37°C、5%二氧化碳的湿化培养箱中，孵育至少两小时。

接着，用温热的DMEM F12洗涤孔板。在每孔支架中加入约500,000个人类神经干细胞（HNSCs），接种于含生长因子的150微升RMM培养基中。将孔板置于培养箱中孵育3小时，使细胞沉降并进入支架内部。

3 小时后，向每个孔中加入 3.5 毫升 RMM，注意避免将细胞从支架上脱落。将培养板孵育 7 或 21 天。在第一天（即首次换液）更换培养基，并在首次换液后的 2 至 3 天再次更换培养基。