生成诱导多能干细胞来源的脑类器官

取在支持性基质上培养的诱导性多能干细胞（iPSCs）克隆。

加入含有酶的溶液，将细胞集落解离为单个细胞。

将细胞转移至离心管中，离心后弃去上清液。

用生长培养基重悬iPSCs。

将细胞转移至含有生物相容性聚合物纤维的微孔板中。

离心以促使iPSCs在聚合物支架上聚集形成拟胚体（embryoid bodies，EBs）。

转换至可促进iPSC增殖并分化为神经干细胞、前体细胞及未成熟神经元的神经诱导培养基。

孵育后，细胞会发生自组织。

将类胚体置于带有凹孔的培养板上，并加入含有细胞外基质蛋白的液滴。

孵育以使基质凝固，包埋胚胎体。

将拟胚体转移至含有神经维持培养基的微孔板中。孵育。

EBs 经历细胞增殖，形成突起和芽状结构，并分化为成熟神经元，进而形成脑类器官。

用移液器吸去培养基，并用DPBS洗涤细胞一次。然后，每孔加入500微升细胞解离溶液或0.5毫摩尔EDTA，以解离细胞集落，在37摄氏度孵育3至5分钟。接着，每孔加入1毫升新鲜E8培养基，轻轻吹打使所有细胞脱落。

将全部细胞悬液转移至一个15毫米离心管中，并加入1毫升新鲜E8培养基。然后在室温下以290 g 离心3分钟，沉淀细胞。

弃去上清液后，将细胞沉淀重悬于1毫升E6培养基中，培养基中添加50 µM ROCK抑制剂，并使用血细胞计数板对细胞进行计数。

用添加了ROCK抑制剂的E6培养基制备所需接种密度的细胞悬液。然后，将150微升细胞悬液加入96孔超低吸附培养板的每个孔中。

接下来，在室温下以 290 g 离心 3 分钟，使细胞强制聚集。然后，将培养板置于 37 摄氏度、含 5% 二氧化碳的湿润环境中孵育，以促进拟胚体形成。

孵育24小时后，将培养板转移至超净台，使用移液器小心吸出120微升培养基，注意移液器枪头勿插入过深，以免吸走胚状体。

接着，向每个孔中加入 150 µL 新鲜的 E6 培养基，其中添加 2 µM XAV939 及 SMAD 抑制剂。将培养板放回培养箱，并每天更换新鲜配制的 E6 培养基，培养基中需补充上述抑制剂。

培养第7天，检查所有类胚体是否均已达到550至600微米的直径，并呈现光滑、清晰的边缘。此时，它们已准备好嵌入细胞外基质中。

为了包埋类器官，可将一张长4英寸的热塑性封膜放在一个空的P200盒上，制备出带凹孔的包埋片。然后使用15毫升的锥形管或500微升的微量离心管，轻轻将膜片压入孔中，形成12个或所需数量的凹孔。

接下来，将70%乙醇喷洒在薄膜片上，并在生物安全柜中打开紫外灯，使其干燥至少30分钟。同时，将足量的基底膜基质置于冰上解冻。然后，使用宽口P200枪头，将一个类胚体从96孔板转移至每个凹槽中。用普通枪头尽可能吸除培养基，但切勿让类胚体干燥。

接下来，使用常规预冷的 P200 吸头，向每个类器官中加入约 30 微升未稀释的基底膜基质，确保胚胎体尽可能位于液滴的中央。

将所有拟胚体嵌入基质后，将薄膜置于无菌培养皿中。然后在37摄氏度、含5%二氧化碳的湿润环境中孵育培养皿10分钟，使基质膜固化。

进行类器官分化时，向超低吸附6孔板的一个孔中加入5毫升已配制好的含B27（不含维生素A）的分化培养基。将该6孔板在培养箱中预热至37摄氏度。待基质膜凝固后，从薄膜片背面轻推凹陷处，将包埋的类胚体转移至6孔板中。如有必要，可从孔中取出1毫升培养基，用移液器将其滴加到薄膜片上，以使液滴从薄膜片上脱离。