使用微流体设备生成神经肌肉接头

从聚合物涂层的微流控装置开始，该装置具有互连的孔，带有通过微槽连接的镜面隔间。

神经祖细胞接种到一个隔室的孔中。

允许它们迁移到互连通道中并粘附在聚合物上。

与生长培养基覆盖，以促进神经元成熟为运动神经元。

在对面的隔间中，用肌肉祖细胞播种孔，这些细胞迁移并粘附在相互连接的通道上。

分化培养基代替培养基，诱导肌肉祖细胞融合，形成多核肌肉细胞。

将含有生长因子的神经元分化培养基添加到含有肌肉细胞的隔室中。

同时，向含神经细胞的隔室中加入半体积的无生长因子培养基。

生长因子和相对隔室中较大体积的培养基促进运动神经元通过微槽扩展其过程。

然后这些神经元过程与肌肉细胞连接，形成神经肌肉接头。

要在微流体装置中接种神经祖细胞或NPC，请使用200微升移液器从装置中微槽一侧的两个孔中取出DPBS。要在右上孔中每个设备将总共 250,000 个 NPC 接种在 60 至 100 微升第 10 天运动神经元培养基中，将一半的细胞悬液接种在靠近通道开口的位置以 45 度角

暂停几秒钟，让细胞悬液流过通道，然后将剩余的一半细胞悬液添加到下孔中。使用笔将接种面标记为 NPC 或等效物，以便在没有显微镜的情况下轻松定位设备，并孵育五分钟以连接细胞。接下来，用额外的第 10 天运动神经元培养基缓慢加满两个 NPC 接种孔，使每孔总体积为 200 微升。使用200微升移液器，从与新接种的NPC相对的微槽另一侧的两个孔中取出DPBS。

每孔向未接种孔中加入 200 微升第 10 天运动神经元培养基。然后，在设备周围每 10 厘米培养皿添加 6 毫升 DPBS，以防止培养基在孵育过程中蒸发。

要更换培养基，请将 200 微升移液器吸头放置在通道开口对面的孔壁底部边缘，缓慢去除两个孔中带有 NPC 的培养基。为防止强培养基流损坏通道中的细胞，通过在顶部和底部孔之间不断变化，缓慢地向每个孔中添加 50 至 100 微升新鲜运动神经元培养基。重复该过程，直到每个孔含有 200 微升培养基。

在运动神经元分化的第17天，用200微升移液器去除装置中微槽未接种侧的运动神经元培养基，并用DPBS洗涤孔。通过将一半的细胞悬液接种在顶部孔中，在每个装置的 60 至 100 微升生长培养基中接种总共 200,000 个人原代成血管母细胞或 MAB。

暂停几秒钟，让细胞悬液流过通道，然后将剩余的一半细胞悬液接种在底部孔中，如前面对接种NPC所示。将设备孵育五分钟以进行细胞附着。然后，用额外的生长培养基填充两个新鲜接种的 MAB 孔，并按照演示再次孵育。

为了在运动神经元分化的第21天启动趋化和体积梯度，将每孔200微升含有生长因子的运动神经元基础培养基添加到肌管室中。然后，向运动神经元室中加入每孔100微升不含生长因子的运动神经元基础培养基。