构建耦合微电极阵列的三维神经元网络

取大鼠胚胎海马神经元的悬浮液。

将神经元转移至微电极阵列（MEA）上涂有黏附因子的活性区域。该活性区域由聚合物结构限定。

孵育 MEA。神经元会黏附在包被的 MEA 活性区域上，形成二维神经元网络。

此外，将神经元转移至多孔板内膜插件中涂有黏附因子的玻璃微珠单层上。

孵育，使神经元附着于包被有黏附因子的微珠上。

将带有贴壁神经元的微珠转移至含有神经网络的限定MEAs区域。

微珠自组装形成六边形结构。

在MEA上重复多次微珠转移操作，使微珠自组装形成多层结构，构建致密的三维结构。

向MEA限定的活性区域加入培养基并进行孵育。

神经元生长，形成相互连接的三维神经网络。

将细胞以每平方毫米2,000个细胞的密度接种到MEA的活性区域上，该区域由PDMS约束界定，以形成二维神经元网络。随后，将MEA装置放入37°C、5%加湿二氧化碳环境的培养箱中。

为完成三维培养构建的初步步骤，将160微升细胞浓度为每微升600至700个细胞的悬液均匀分布于置于多孔板内的微珠单层表面。随后，将多孔板放入37°C、含5%湿润二氧化碳气氛的培养箱中孵育。

铺板后六到八小时，将含有微珠和神经元的 30 至 40 微升悬浮液转移至由 PDMS 限制圈定的 MEA 区域。每次转移后，等待约半分钟，使微珠自组装成六方密排结构。待所有层沉积完毕并自发组装后，在 PDMS 限制圈定区域的上方加入 300 微升培养基。

将与微电极阵列（MEA）耦合的三维结构置于37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中培养48小时。