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神经科学
0 次观看 • 4:51 分钟 • July 8th, 2025
将小鼠大脑皮层切成小块，并转移至含有缓冲盐溶液的冷解剖液中。
加入消化酶以解离细胞外基质。
为去除残留酶，用冷解剖液清洗。
用星形胶质细胞富集培养基替换该培养基。
接下来，使用移液器解离组织块。
将悬液通过滤网过滤，以去除未解离的组织，获得单细胞。
将细胞转移至带正电荷的聚合物包被的培养板中。在振荡条件下孵育。
星形胶质细胞牢固贴壁，而结合松散的神经元、小胶质细胞和少突胶质细胞则脱落。
富集培养基可将成熟的星形胶质细胞转化为可分裂的多边形星形胶质细胞。
去除脱落的细胞，并用磷酸盐缓冲液洗涤星形胶质细胞。
加入消化酶以解离星形胶质细胞。
加入含血清的培养基以终止酶活性。将星形胶质细胞收集至离心管中并离心。
弃去上清液。将细胞重悬于星形胶质细胞成熟培养基中，以促进典型的星形成熟星形胶质细胞结构的形成。
将用于生成星形胶质细胞的任何皮质组织切成不超过1立方毫米的组织块。待所有组织块收集完毕后，静置使其沉降至管底，随后尽可能吸除上清液。接着加入2至3毫升0.05%胰蛋白酶EDTA溶液，并将样本置于37°C水浴中孵育20分钟。
随后，小心吸除胰蛋白酶EDTA，使组织块底部仅残留最少液体。接着，加入5毫升预冷的解离培养基以洗去残留的胰蛋白酶EDTA，并用移液器沿上层管壁吹打，使组织块充分混匀。然后吸除解离培养基，使组织块尽可能残留最少液体。
用预冷的解剖培养基重复此洗涤步骤两次。最后一次洗涤后，加入 1 毫升室温的 DMEM PLUS，并通过上下吹打滴定组织，注意避免产生气泡。
星形胶质细胞对pH值非常敏感，因此应避免产生气泡，因为这可能会改变溶液的pH值。
接下来，将一个100微米细胞筛置于50毫升离心管管口，并用4.5毫升预冷的DMEM PLUS润湿滤膜。用移液器将1毫升解离后的组织悬液加入细胞筛中，再加入4.5毫升预冷的DMEM PLUS冲洗，使细胞通过滤膜。第天 在 体外 解剖后，将含有细胞的10厘米培养皿置于含DMEM PLUS的培养基中，放入培养箱内的摇床上，以110转/分钟振荡6小时。
在六小时振荡结束前20至30分钟，将1×PBS、DMEM PLUS、NB+H和0.25%胰蛋白酶EDTA在水浴中预热至37摄氏度。六小时振荡结束后，从振荡器上取下培养皿，并立即用每皿10毫升预热的1×PBS更换培养基。随后吸除PBS，每皿加入3毫升预热的胰蛋白酶EDTA。
然后，将样品在37摄氏度下孵育4分钟。接着，向每皿中加入5毫升预热的DMEM PLUS至3毫升胰蛋白酶EDTA中。用移液器吹打使细胞脱离培养皿，并将细胞悬液收集至50毫升离心管中。随后，在20摄氏度下以3,220 × g 离心4分钟。然后弃去上清液，再将细胞沉淀重悬于1毫升预热的NB+H中。