体外神经元与巨噬细胞共培养体系的建立

从分离的小鼠背根神经节神经元开始，置于生长培养基中。

将它们接种到聚合物包被的多孔板上，以促进神经元黏附。

接下来，取一只已解剖的安乐死小鼠，向其腹腔内注射冰冷的 PBS。

轻轻按摩腹膜，使巨噬细胞从腹膜壁上脱落。

挤压小鼠以收集腹腔液体，并加入裂解缓冲液处理，选择性裂解作为污染物的红细胞。离心后，将细胞重悬于培养基中。

将巨噬细胞转移至含有培养神经元的孔板内的多孔插入式培养小室中。

这种共培养使神经元和巨噬细胞能够紧密相邻。

用db-cAMP处理共培养物，并进行孵育以促进其进入细胞。这会激活神经元分泌信号分子。

这些信号分子与db-cAMP共同诱导巨噬细胞获得促再生表型，并分泌对神经元轴突生长至关重要的因子。

在接种细胞前，使用多聚-D-赖氨酸和层粘连蛋白预包被6孔板。接着，将6孔板在37摄氏度下与0.01的多聚-D-赖氨酸孵育两小时，或在4摄氏度下孵育过夜。之后，用蒸馏水洗涤孔板两次。

然后，将培养板与浓度为每毫升3微克的层粘连蛋白溶液在室温下孵育2小时。随后，用蒸馏水洗涤培养板两次，并在室温下干燥至少1小时。

现在，使用手术刀在已处死的小鼠脊柱上方的皮肤上做切口，双侧解剖椎旁肌肉以暴露椎骨。使用尖端较细的外科刮匙仔细去除椎骨，直至背根神经节（DRG）完全暴露。

在解剖显微镜下，使用虹膜剪和精细镊子从S1水平开始双侧分离，一直向上至C1水平，取出背根神经节（DRG）。使用剪去末端的蓝色吸头将DRG转移至1.5毫升离心管中。

然后，使用小型离心机快速离心数秒，弃去 DMEM。加入 1 毫升含有 125 单位/毫升 I 型胶原酶的 DMEM，并在 37 摄氏度下轻轻旋转（使用旋转器或摇床）孵育 90 分钟。

随后，弃去含有胶原酶的 DMEM，并加入 1 毫升新鲜 DMEM。使用剪去末端的蓝色吸头将背根神经节（DRG）转移至 15 毫升锥形管中。然后轻轻吹打至少 15 次，以制成均匀的细胞悬液。

将离心管在239 g 条件下离心3分钟，小心弃去含有漂浮碎片的上清液。加入1毫升添加了B27的神经基础培养基，通过轻柔吹打5到10次重新悬浮细胞沉淀。

接下来，将细胞悬液通过置于50毫升锥形管上方的70微米细胞筛网过滤。然后，将所有收集到的背根神经节（DRG）神经元接种至6孔板的两个孔中。

为了从成年小鼠中制备原代腹腔巨噬细胞，需小心切开腹部皮肤以暴露腹膜，避免切割腹膜，以防灌洗液泄漏。

接下来，使用带有22号针头的注射器穿刺腹膜，向腹腔内注入10毫升冰冻的磷酸盐缓冲液（PBS）。轻柔按摩腹膜1至2分钟。然后拔出针头，通过针孔处挤出PBS，并将灌洗液收集至50毫升的锥形管中。

随后，在 4 摄氏度条件下，以 239 g 离心 10 分钟，使细胞组分沉淀。接着，在室温下用 3 毫升红细胞裂解缓冲液重悬沉淀物，孵育 3 分钟。

然后，在 4 摄氏度下以 239 g 离心细胞悬液 10 分钟。将沉淀的细胞重悬于 1 毫升神经基础 B27 培养基中。将所有收集的巨噬细胞的一半接种到有效面积为 4.2 平方厘米的细胞培养小室上，该小室置于解离的背根神经节（DRG）培养孔的上方。

神经元与巨噬细胞共培养4小时后，向共培养体系中加入2微升100微摩尔的db-环磷酸腺苷（db-cyclic AMP）溶液。24小时后，在同一6孔板中，向一个空孔加入1毫升巨噬细胞培养基。

将神经元-巨噬细胞共培养中的细胞培养小室转移至含有巨噬细胞培养基的空孔中。