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神经科学
0 次观看 • 4:51 分钟 • July 8th, 2025
取一只已处死的大鼠。
打开腹腔，切除膀胱，并将其浸入缓冲液中。
切开膀胱并去除附着的脂肪和组织碎片。
将膀胱转移至含有缓冲液的离心管中，离心并去除碎片。
将组织置于含有胶原酶的溶液中并进行剪碎。加入更多胶原酶以降解细胞外基质，使细胞松散。
离心并弃去上清液。加入胰蛋白酶以破坏细胞间连接，释放细胞。
加入含有蛋白质的洗涤液以灭活胰蛋白酶，然后离心并移除上清液。
用培养基重悬细胞；过滤以去除聚集体，获得单细胞悬液。
离心并弃去上清液。用培养基重悬细胞。
将细胞接种于包被的盖玻片上，以促进神经元和胶质细胞的贴附。去除未贴壁的细胞。
加入含有生长因子的神经元培养基，以促进细胞成熟，建立原代神经元和胶质细胞培养体系。
首先将大鼠置于无菌手术巾上，暴露腹部。使用剪刀和镊子切开腹腔，暴露膀胱。用另一把剪刀和镊子轻轻提起膀胱，并从膀胱颈处将其剪下。
然后，迅速将膀胱置于冰冷且含氧稳定的克雷布斯（Krebs）溶液中，以提高细胞存活率。将克雷布斯溶液分别加入三个玻璃培养皿和三个玻璃烧杯中，并将其放入冰浴中预冷。将培养皿和烧杯编号为1、2、3，以避免混淆。
在玻璃皿1中，使用眼科剪刀切开膀胱，并用镊子和勺状核分离器将其展开。在玻璃烧杯1中冲洗膀胱，然后将其放入玻璃皿2中。使用镊子和眼科剪刀去除组织表面附着的脂肪。随后，在烧杯2中冲洗膀胱，并将其放入皿3中。
用镊子和勺状细胞核分离器轻轻刮除膀胱上的外源性附着物。将膀胱在3号玻璃烧杯中冲洗，然后转移至含有14毫升冷克雷布斯液的15毫升离心管中。在360 × g条件下离心1分钟 g 4摄氏度。
将膀胱从离心管转移至含有1毫升消化液的2毫升小瓶中。使用眼科剪将膀胱剪成小块。在无菌细胞培养皿中，将膀胱组织与9毫升消化液1混合。在37摄氏度、5%二氧化碳、200转/分钟的摇床培养箱中进行第一次消化，持续1小时。第一次消化完成后，在4摄氏度下以300 × g 离心8分钟。
同时，将消化液2置于37摄氏度水浴中预热。离心后，除去含有消化液1的大部分上清液，保留少量上清液以避免细胞损失。
将细胞重悬于预热的消化液2中，在37摄氏度水浴中振荡消化5分钟。消化完成后，立即加入10毫升冷冲洗培养基以终止胰蛋白酶作用。在4摄氏度条件下，以360 × g 离心8分钟。随后，尽可能彻底去除上清液，以清除全部胰蛋白酶。
用3毫升神经元培养基轻轻重悬沉淀，注意避免在溶液中产生气泡。将悬液通过70微米细胞筛过滤至50毫升离心管中。在4摄氏度下以360 × g 离心8分钟收集细胞。然后，用1毫升神经元培养基A轻轻重悬细胞沉淀，并将500微升细胞悬液加入48孔板的每个孔中。在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养细胞。