建立牙髓细胞与三叉神经元的共培养体系以实现交互通讯

从富含间充质干细胞的小鼠牙髓组织中开始制备细胞悬液。

孵育以促进细胞贴壁和增殖，形成单层细胞。

将经层粘连蛋白包被的多孔膜小室放入含有牙髓细胞的孔中。

使用含有从小鼠脑中提取的三叉神经元的共培养培养基接种插入物。孵育以使神经元贴壁。

用含有尿苷和5-氟-2-脱氧尿苷等生长调节剂的共培养基替换原培养基。

这些分子进入细胞后，通过抑制DNA合成来调控活跃增殖的间充质干细胞的生长。

随着时间推移，间充质细胞会分泌小分子信号分子，这些分子穿过孔膜，刺激三叉神经元。

这种刺激会导致三叉神经元的神经突起向间充质细胞延伸。此外，神经元还会分泌信号分子，实现细胞间的相互通讯。

处死小鼠后，将其头部置于一次性垫巾上，使口部朝上，颈部基部平放于工作台面。使用剃须刀片以锯动方式将下颌骨与上颌骨分离。用剪刀或镊子移除舌头，以便更方便地接触到磨牙。

将打开的头部置于铺有无菌纱布的培养皿中，并将样本放置于解剖显微镜下。去除第一磨牙周围 的牙槽骨组织。将镊子插入牙槽开口，从牙齿向口腔的颊侧或舌侧方向轻轻剥离组织。

收集所有上颌第一磨牙，并用镊子小心地将下颌和上颌第一磨牙转移至另一含有冰上预冷的1×PBS的细胞培养皿中。去除包绕在每颗上颌第一磨牙外侧的釉质外组织。用一对镊子旋转磨牙，使牙尖朝下，暴露开放的牙根。牙齿底部有一个椭圆形开口，其内由一层薄的牙本质和釉质包裹着不透明的牙髓组织。

用镊子的尖端轻轻松动牙髓组织，将镊子的一侧伸入矿化组织的内周进行操作。将牙髓组织从矿化结构中取出，并转移至第三个含有1×PBS的培养皿中。如果外层釉质器官尚未分离，则将其去除。

将所有牙髓组织转移至含有0.25%胰蛋白酶-EDTA的50毫升锥形管中。涡旋混匀后，置于37摄氏度水浴中孵育10分钟。在无菌操作台内，加入预热的共培养培养基，使培养基与胰蛋白酶的最终比例至少为1:1，以中和酶活性。使用10毫升移液器反复吹打液体多次，使牙髓组织在培养基中进一步分散。注意避免产生大气泡。

将1毫升分散的牙髓组织转移至24孔组织培养板的每个孔中。将培养板置于37摄氏度的培养箱中，孵育48小时，使细胞贴壁并从未分散的组织中迁移出来，然后更换培养基。

安乐死后去除皮肤，将显微解剖剪的尖端插入颅底。沿颅骨的矢状缝剪开。做四个小的横向切口——两个沿耳侧的冠状缝，两个沿颅底的人字缝。这样可形成两片骨瓣。

用镊子掀开两片骨瓣以暴露脑组织。在上颌突的骨与脑之间的硬脑膜内定位三叉神经节。剪断通往眼睛、上颌和下颌的三个分支，并使用直头精细镊子将神经节转移至冰上培养皿中的冷1×PBS溶液中。

待所有三叉神经束采集完毕后，使用瓶用镊子将神经节转移至含有5毫克/毫升无菌过滤的II型胶原酶的50毫升锥形管中。涡旋混匀后，将管子置于37摄氏度水浴中消化25至30分钟。每5至10分钟取出管子涡旋一次，随后放回水浴中。

将胶原酶三叉神经元溶液在643