使用一次性生物反应器从诱导多能干细胞生成成熟小脑类器官

将人诱导性多能干细胞（iPSCs）接种至生物反应器中。用含有细胞凋亡抑制剂的培养基重悬 iPSCs。

在磁场作用下，生物反应器的垂直转轮以受控速度旋转，促进细胞间接触和聚集体形成。移除大部分培养基，并加入不含抑制剂的新鲜培养基。

继续培养。当聚集体达到最佳大小后，静置使其依靠重力沉降。移除培养基。

加入含有生长因子的分化培养基，并以降低的生物反应器转轮速度进行培养。生长因子可促进类球体内部的神经分化。

接着，加入新鲜培养基，并补充可诱导小脑前体细胞发育的生长因子和趋化因子。

逐渐地，小脑前体细胞在类器官聚集体内分化为不同的层次结构，形成早期小脑类器官。

最后，加入含有特定神经营养因子的神经元培养基。

这些因子诱导小脑前体细胞成熟为具有突触活性的功能性小脑神经元，从而生成成熟的类器官。

第1天（以接种生物反应器的当天为第0天），将生物反应器和基础单元置于无菌操作台中。随后，使用移液管吸取1毫升细胞悬液样本，将其接种至超低吸附24孔板中。在显微镜下确认是否已形成由iPSC衍生的细胞聚集体。若已形成，则以40倍或100倍放大倍数拍摄聚集体的图像。

继续在生物反应器中培养iPSCs，直至细胞聚集体的平均直径达到100微米。随后，更换80%的培养基为新鲜的mTesR1培养基（不含ROCK抑制剂）。当聚集体直径达到200至250微米时，使所有类器官沉降至生物反应器底部，然后将全部用过的培养基更换为gfCDM分化培养基。

将底座单元和生物反应器放入培养箱中，并将振荡速度降低至 25 RPM。