从小鼠脑组织中分离肿瘤浸润性免疫细胞

取一个带有肿瘤的灌注小鼠脑组织。

灌注步骤可去除循环中的免疫细胞，但保留肿瘤浸润的细胞。

分离含有肿瘤的组织。

现在，机械性地解离组织。

机械力使组织松动，从而释放出细胞。

将解离的组织转移至离心管中。

离心并弃去含有碎片的上清液。

将组织重悬于含有胶原酶和DNase的消化液中。

胶原酶降解细胞外基质，释放细胞。脱氧核糖核酸酶降解污染的DNA。

加入缓冲液以终止酶活性。

过滤悬浮液以去除细胞团块，获得单细胞悬液。

离心并弃去上清液。

将细胞重悬于高密度梯度介质中。随后覆盖低密度梯度介质，形成具有清晰界面的分离梯度。

离心以分离各层。免疫细胞聚集在梯度介质的界面处，而细胞碎片则漂浮在上层。

收集免疫细胞以进行后续分析。

在此操作中，使用洁净的单刃剃刀片，通过在脑正中做矢状切口以分离两半球，从而切取包含肿瘤的脑区。将同侧半球内侧面朝下放置，于小脑处做一冠状切口，于嗅球处做另一切口，以分离包含肿瘤移植组织的目标组织。

接下来，将目标组织放入已标记的底部为玻璃的组织研磨器中，加入1毫升DPBS。将推杆完全推到底部，旋转七次以破碎组织。随后，提起推杆，使液体重新沉降至组织研磨器底部。重复此步骤三次。但在接下来的两次重复中，仅将推杆旋转四次，最后一次重复时旋转三次，以避免过度研磨脑组织。

随后，将三份1毫升的冰冻DPBS沿研杵壁加入，以冲洗残留的脑组织进入组织研磨器中。然后，通过上下吹打重悬匀浆后的脑组织，并将其转移至预贴标签的15毫升离心管中，置于冰上。再用额外1毫升冰冻DPBS冲洗DAPS组织研磨器内壁，并将冲洗液加入同一支15毫升离心管中。

将所有含有经机械解离的脑组织的离心管置于冰上，直至所有样品处理完毕。随后，将15毫升离心管中的机械解离脑组织在4摄氏度下以740 × g 离心20分钟。接着，弃去上清液，并将沉淀的脑组织重悬于1毫升预先配制的胶原酶和DNase I消化酶混合液中。

将15毫升离心管放入试管架中，然后将试管架置于37°C水浴中15分钟，在孵育期间，通过轻轻弹动管壁两次，温和地搅动样品，以促进组织解离。

随后，向每根试管中加入 6 毫升预冷的 DPBS，以稀释消化酶。用移液器吹打混匀，将全部液体通过无菌的 70 微米尼龙滤网过滤，收集至预冷的、已标记的新 15 毫升离心管中。

随后，以740 × g离心脑细胞悬液 g 在4摄氏度下离心20分钟，以获得单细胞沉淀。将15毫升离心管从离心机中取出并置于冰上。随后，将离心机的温度设定升高至约21摄氏度，以准备下一步操作。

接下来，完全去除细胞上清液，并先用 P1000 微量移液器将细胞沉淀重悬于 1 毫升 70% 密度梯度离心液中。然后，向每根试管中再加入 4 毫升 70% 密度梯度离心液。盖紧管盖，通过轻轻反复倒置试管数次，使细胞悬液充分混匀。

随后，将含有脑细胞并悬浮于70%密度离心介质中的15毫升离心管从冰上转移至室温下的试管架中。每次取一个离心管，小心地在5毫升70%密度离心介质上方叠加2毫升37%密度离心介质溶液，形成两层密度离心介质之间的清晰界面。

然后，用细头记号笔标记两层之间的界面位置，以便在离心后界面变得不明显时仍能轻松识别。将15毫升离心管在室温下以740 × g 离心20分钟，离心过程中不得使用刹车，以避免破坏密度梯度离心介质层之间的界面。

随后，将P200移液器插入离心管中，小心避开脂质层，收集位于两层密度梯度离心介质界面处积累的外周血单个核细胞（PBMCs）。到达PBMC层位置后，缓慢从70%密度梯度离心介质层表面吸取200微升液体，转移至预先标记好的聚丙烯FACS管中，并置于冰上。重复此步骤一次，使每份样品总体积达到400微升。