建立大鼠脑源性胶质细胞的三维培养

取一块含有源自大鼠脑组织的贴壁胶质细胞培养物的微孔板。该培养物包含星形胶质细胞、小胶质细胞和少突胶质细胞。

移除培养基，加入酶溶液孵育以使细胞脱落，然后将细胞转移至离心管中。

离心并去除含有细胞碎片的上清液。在温热的培养基中重悬细胞。

使用注射器吹打以分散细胞团块，并通过滤网过滤，获得单细胞悬液。

加入光交联生物聚合物、交联剂和细胞外基质组分。

将混合物倒入固定在盖玻片上的模具中。用高强度光照照射混合物，以诱导交联反应，形成凝胶并包埋胶质细胞。

取出模具，将盖玻片放入微孔板中。加入预热的培养基，并在生理条件下孵育凝胶。

细胞在支撑性的细胞外基质内增殖并形成细胞网络，从而建立胶质细胞的三维培养体系。

细胞包封前24小时，吸出两周龄原代培养物的培养基，每孔加入1毫升新鲜培养基。在细胞包封当天，为每块12孔板准备12.5毫升稀释胰蛋白酶和25毫升培养基，并在水浴中预热至37摄氏度。然后，使用10毫升移液管向12孔板的每孔中加入约1毫升稀释的胰蛋白酶。

在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育20至30分钟，直至融合的细胞层从培养板上脱落。孵育结束后，使用1毫升移液器回收脱落的细胞（应呈现为单一片状漂浮物），并转移至15毫升锥形离心管中。加入等体积的培养基稀释后，在室温下以200 × g 离心2分钟。

离心后，弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于10毫升预热的培养基中。用移液器吹打细胞5次，然后在200 × g 条件下再次离心2分钟。离心结束后，倾去上清液，将细胞重悬于5毫升预热的培养基中，并将细胞转移至50毫升锥形离心管中。

然后，使用带有18号针头的10毫升注射器将细胞溶液吹打三次，并通过40微米细胞滤网将悬液过滤至新的锥形离心管中。接着，取10微升细胞悬液，用预温培养基按1:100稀释，使用自动细胞计数仪进行细胞计数。

将剩余细胞置于37摄氏度水浴中孵育，直至进行包封步骤。为每块植物12孔板的3D水凝胶，预热12.5毫升未使用培养基和12.5毫升条件培养基。然后，按每块植物12孔板称取7毫克HAMA，加入无菌过滤溶液中，使其终浓度为2%（重量/体积）。将溶液在20千赫兹下超声处理60分钟，直至HAMA完全溶解。

超声处理的同时，分别配制TEA和NVP的10%溶液。另取无菌PBS，每1毫升分装，配制成1毫摩尔的曙红溶液。随后，针对每个12孔板，制备终体积为1.4毫升的混合液，其中包含1 × 10⁷个细胞、0.5% HAMA、PBS中20%的基底膜混合物、0.1% TEA、0.1% NVP以及0.01毫摩尔的曙红Y。

轻轻混匀溶液后，使用装有1毫升吸头的移液器向每个PDMS模具中加入100微升。然后，将样品置于密闭盒子中，在室温下用高强度绿色LED光照5分钟。

五分钟的绿色LED照射对于形成三维凝胶至关重要。由伊红Y引入的红色会逐渐变为透明，表明反应已终止。

接下来，向12孔板的每个孔中加入1毫升温热的预平衡培养基；用拇指和食指夹住每个盖玻片，使用弯头镊子缓慢剥离PDMS模具，避免移位凝胶。将模具放入含有预平衡培养基的孔中。

脱模是最具挑战性的步骤，必须极其小心地进行，以防止凝胶脱落或盖玻片破裂。这可能需要多次练习。

将所有类器官转移至孔板的各孔后，向每孔额外加入 1 毫升预热的 DMEM/F12 培养基。将孔板置于 37 °C、5% 二氧化碳条件下孵育两周，然后进行成像。