利用人多能干细胞生成与维持星形胶质细胞球

从经细胞外基质包被的培养板开始，在含有Rho激酶抑制剂的生长培养基中接种人多能干细胞簇。

细胞外基质（ECM）可增强细胞黏附，而抑制剂则阻断Rho激酶，防止细胞凋亡，促进细胞存活与增殖。

加入神经分化培养基，以诱导干细胞分化为神经前体细胞。

使用解离溶液处理；该溶液中的酶可降解细胞外基质（ECM）和细胞间连接，从而使细胞释放出来。

将它们转移至含有Rho激酶抑制剂的未包被培养瓶中。

这些抑制剂可促进细胞存活并自发聚集成三维结构或球状体。

使用富含生长因子的神经分化培养基培养类球体，以促进神经前体细胞分化为星形胶质细胞前体并形成星形胶质细胞球。

定期加入解离溶液，将星形球体解离成较小的细胞簇。这有助于营养物质到达球状体内部的细胞，从而维持其活性。

将星形球体维持在新鲜培养基中，以使前体细胞成熟为星形胶质细胞。

首先，将hPSCs细胞团接种于已包被ECM的六孔板中，每孔加入含Rho激酶抑制剂Y-27632的2毫升hPSC培养基。维持干细胞培养至细胞融合度约50%。随后，更换为含SP-431542和DMH1的神经诱导培养基，以促进神经分化。

当细胞融合度达到约95%时，将每孔以1:6的比例传代至新的ECM包被的孔中。第14天，用解离液解离细胞，并将每孔内容物转移至含Y-27632的培养基中的未包被T-25培养瓶，以促进细胞聚集体的形成。

为了在自发形成的三维聚集体中生成星形胶质细胞前体细胞和星形胶质细胞，需转换至含有EGF和FGF2的神经培养基，并每三到四天换液一次，直至四到六个月时确认星形胶质细胞身份。

默认情况下，本方案可生成背侧皮层星形胶质细胞。然而，如有需要，可通过添加模式化形态发生素来实现星形胶质细胞亚型的区域性特化。

每周一次，当出现深色中心时，通过离心收集球体，然后用解离液轻柔解离H-astro聚集体。仅重新接种那些未自发贴壁的球体，以避免传代非中枢神经系统和非神经细胞。