背根神经节神经元的分离及与施万细胞前体共培养以生成施万细胞

取附有包含神经元和胶质细胞的背根神经节（DRG）的大鼠胚胎脊髓。

从脊髓上分离单个背根神经节，转移至离心管中，离心后弃去组织碎片。

加入酶以解离背根神经节神经元和胶质细胞。

离心细胞并去除所有碎片。加入神经元维持培养基，吹打重悬以制备单细胞悬液。

将悬液转移至包被有培养基质的微孔板中，以促进细胞贴壁。

加入纯化培养基并进行孵育。培养基中的抑制剂可清除正在分裂的胶质细胞，而未分裂的神经元则得以存活。

在共培养培养基中取施万细胞样细胞（SCLCs）。SCLCs 是施万细胞的前体细胞，可与胚胎外周神经元相互作用。

将悬液加入背根神经节神经元中并进行孵育。小细胞肺癌细胞与背根神经节神经元的相互作用可促进其向施万细胞的成熟。

生成的施万细胞已准备好进行分析。

为收获背根神经节，将第一个胚胎转移至一个直径10厘米、含有室温磷酸盐缓冲液（PBS）的培养皿中，在解剖显微镜下使其呈俯卧位，然后将显微解剖镊子沿脊髓两侧插入。

使用钝性分离法，用镊子沿颈部切口和尾部残端将脊髓与周围软组织分离，并切除脊髓。清除游离脊髓上残留的软组织，直至仅剩脊髓、神经根及附着的背根神经节。

将各个背根神经节从其相连的神经根上分离下来。然后，使用装有1毫升移液枪头的移液器，将最多100个背根神经节转移至含有PBS的1.5毫升微量离心管中。

通过离心收集神经节，并将沉淀物重新悬浮于每管200 µL的重组酶消化细胞解离试剂中。在37°C孵育10分钟后，使用200 µL移液枪头在背根后节神经元维持培养基中轻轻吹打重悬背根神经节沉淀物，再次进行离心。

将背根神经节细胞以每平方厘米 5 × 10³ 个细胞的密度接种于六孔板中，每孔加入 1.5 毫升背根神经节神经元维持培养基，六孔板预先用多聚-D-赖氨酸和层粘连蛋白包被。

在37摄氏度和5% CO₂ 条件下培养两天后，洗涤细胞，并将神经元细胞培养物转移至新鲜的背根神经节神经元纯化培养基中，放回培养箱继续培养两天。

经过3到4次传代和纯化后，背根神经节细胞培养物应呈神经元标志物Tuj-1阳性，胶质细胞标志物S100 beta阴性。

在施万细胞样细胞培养的第7天，用PBS冲洗细胞，随后每孔加入0.5毫升重组酶消化细胞解离试剂，在37摄氏度下作用5分钟进行解离。将细胞沉淀重悬于共培养培养基中，并以每平方厘米1 × 10³个细胞的密度将施万细胞样细胞接种至纯化的背根神经节神经元培养物上，在37摄氏度和5% CO₂条件下共培养14天。