使用可变数目串联重复序列（VNTR）- 片段长度分析（FLA）对Mycobacterium leprae菌株进行DNA指纹图谱分析

本实验的总体目标是从临床样本中直接获得麻风分枝杆菌（Mycobacterium leprae）——一种不可培养的麻风病致病菌——的独特DNA指纹图谱。从患者活检组织中提取的M. leprae细菌DNA，通过使用针对可变数目串联重复（VNTR）位点的荧光引物进行多重PCR扩增。DNA扩增完成后，采用毛细管电泳进行片段长度分析。

通过分析数据来确定每个位点上短串联重复DNA片段的数量。由于EPRI的不同菌株在每个位点上的串联重复次数各不相同，因此多个位点的数据可产生独特的DNA指纹图谱，并可利用该技术建立患者菌株类型的数据库。

通过分析特定社区内及全球范围内患者之间麻风病的种群结构、进化关系和传播模式，可为麻风病的消除提供遗传学工具和科学证据。该方法可用于追踪麻风病的传播路径，识别近期感染聚集病例和高风险个体，并评估防控项目的有效性。演示本实验操作的人员包括我实验室的研究人员 Lee 和 Ron Jensen，以及仪器核心设施的 Jason Rivers。使用标准的 KaiGen DNA 提取试剂盒从临床活检样本中提取 DNA。

获得DNA后，在洁净的PCR操作柜内设置新的工作区域。为避免DNA污染，使用70%乙醇擦拭操作柜和一套移液器，并将操作柜和移液器置于紫外灯下照射15分钟。操作柜清洁完毕后，可开始配制多重PCR反应体系，每个多重PCR反应包含四到五对引物，其中每对引物中的一条带有荧光标记。

必须进行混合。使用TE缓冲液配制的10微摩尔引物储备液来制备引物混合物：在同一个离心管中加入等量的所有正向（或上游）引物，使终浓度达到2微摩尔。根据需要，为每种引物补充TE缓冲液。

另取一个八联管，以相同方式混合所有反向引物或下游引物。引物混合物制备完成后，配制PCR MES混合液。制作一张板图，标注每个样本及其对应的对照。

混合液中应包含12微升KaiGen多重PCR混合液、每种引物混合液各2微升以及2微升Q溶液。务必配制足量的混合液，以包括对照反应并补偿移液过程中的损耗。将混合液短暂离心。

接下来，将18微升主混合液分装到PCR板的每个孔中。为避免污染DNA样本，请更换手套，擦拭并消毒另一台生物安全柜。与之前相同，在通风橱完成去污染后，将PCR板转移至该通风橱内。

然后向每个含有主混合液的孔中加入2 µL DNA样本。务必使用防气溶胶的移液器吸头以避免交叉污染。仔细密封PCR板，并短暂离心以混匀内容物。

然后将反应板放入热循环仪中，并启动用于提交样品的PCR程序。对于FLA，准备甲酰胺尺寸标准品、主混合液，并将稀释后的PCR产物加入洁净的微量离心管中，每份待测样品加入12微升高纯度甲酰胺溶液和0.3微升GeneScan™ 500 LIZ®尺寸标准品。将上述溶液每孔分装12.3微升至96孔光学级反应板中。

PCR 完成后，将反应板离心。务必记录每个样品在板图上的位置。然后在另一个 96 孔板中，每孔加入 59 微升无核酸酶水，并向每孔加入 1 微升 PCR 反应产物，使扩增的 DNA 按 1:60 的比例稀释。

DNA稀释后，使用多通道移液器将每种稀释后的PCR样品各取一微升，转移至含有甲酰胺松散溶液的对应孔板中。程序完成后，可通过标准琼脂糖凝胶电泳检测样品，以确认在此阶段已扩增出预期大小的DNA片段。在使用FLA遗传分析仪进行荧光毛细管电泳分析前，需对样品进行分析前准备：向孔板加装隔垫，短暂离心以去除气泡，并使样品沉入孔底。

IDE 溶液将通过化学方式使DNA链变性，因此无需加热变性。将样品板放入上样托盘中。使用毛细管电泳方法（如ABBI'S遗传分析仪3130 xl）对标记的PCR产物进行分析。

使用填充了POP7聚合物作为分离介质的50厘米毛细管对样品进行分析。DNA在毛细管中迁移至末端，由激光和检测器测量荧光标记，打开分析仪的采集软件。在运行样品前，需对分析仪进行校准，以检测所有使用的染料，包括作为大小标准的ABIs G5。这些样品采用电激进进样，条件为1.6千伏，持续15秒。

通过施加15千伏电压持续1800秒来分离片段。每次运行的总运行时间约为45分钟。运行结束后，为每个样品创建数据文件。

文件由分析仪的采集软件放置在预定位置的板文件夹中。文件格式为 FSA。FLA 数据可使用峰图扫描软件进行分析，该软件可在 Applied Biosystems 网站免费获取。

要分析数据，请点击“开始新项目”，然后点击“添加文件”。将选定的数据文件加载到程序中，包括阳性和阴性对照。选择并分析已加载的文件。

结果以FLA色谱图形式呈现。大小标准品显示为橙色峰，而彩色峰则代表样本中每个分析位点的细菌DNA样本，单击峰可确定其碱基对大小。由于DNA聚合酶滑链合成，某些微卫星位点会检测到一系列相同颜色的峰。

在这些情况下，通常选择幅度最大的峰。将每个样本中的片段大小与阳性对照的大小进行比较，以确定所检测的每个等位基因包含的串联重复片段数量，并将数据记录到 Excel 电子表格中以供进一步分析。在本图中，显示了来自同一村庄三个不同家庭的七位患者的分离株的 DNA 指纹图谱，并标明了所分析的每个多态性位点的串联重复次数。

这些数据表明，B 家族中有两名成员感染了相同的菌株，而另一名成员感染了不同的菌株。C 家族的成员很可能感染了相同的菌株，A 家族的成员也是如此。观看本视频后，您应能够充分理解如何在临床上对麻风病患者常规采用多重 PCR 和片段长度分析，以获得其 V-N-T-R-D-N-A 指纹图谱。

这些是用于补充麻风病防控传统流行病学的新型分子工具。