Name: DNA指纹图谱麻风分枝杆菌株使用可变数目串联重复（VNTR） - 片段长度分析（FLA） (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: 学习使用VNTR分型技术对麻风分枝杆菌进行DNA指纹图谱分析，通过多重PCR和毛细管电泳片段长度分析，从临床标本中追踪麻风传播动态并识别感染集群，为麻风病消除提供分子流行病学工具。

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经费由美国国立卫生研究院/国家过敏与传染病研究所（NIH/NIAID）资助项目RO1-AI-63457以及美国复苏与再投资法案（ARRA）补充资助项目RO1-AI-63457 S1提供。我们感谢实验室全体现任及以往成员和合作者所做出的贡献。

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无利益冲突声明。

从麻风病患者身上采集皮肤样本需要在皮肤科诊所工作的熟练临床医生或技术人员。处理这些样本的实验室工作人员必须格外注意，穿戴实验服、手套和护目镜，并在处理感染的人体或犰狳组织样本时于生物安全柜内操作。对实验台面和工具进行消毒也至关重要。在洁净、无菌的生物安全柜中工作对于避免DNA样本污染具有重要意义。
由于Qiagen等公司开发的提取试剂盒，DNA提取已变得相对容易。必须仔细遵循说明书操作。所有样品在不使用时应保持低温。避免样品经历反复的剧烈温度变化。
本研究所用的DNA引物可从本文末尾参考文献列表中引用的多家公司订购。为避免污染，操作引物时应确保在无DNA的环境中进行。引物通常以干粉形式提供，需用TE缓冲液溶解并稀释至100μM浓度，然后分装为较小体积（图2a）。引物的工作液进一步稀释至10μM浓度。同样，切勿在使用或配制引物的区域或通风橱内使用DNA样品。
不使用时，PCR 产物也应保持低温保存。
3%的琼脂糖凝胶制备可获得更好的DNA条带分离效果，但电泳时间较长。若仅用于定性分析，通常2%的凝胶已足够。用于琼脂糖凝胶中DNA染色的溴化乙锭溶液是一种可通过皮肤吸收的强效基因毒素。操作该溶液及用其染色的凝胶时必须格外小心，并始终佩戴手套。处理任何DNA样品或含溴化乙锭的材料后，应彻底洗手。溴化乙锭染色液、洗涤液及凝胶应按照所在机构的规定进行处置。凝胶电泳步骤并非常规必需；一旦建立FLA方法，此步骤即可省略，因其耗时且消耗试剂。
在FLA样品制备过程中使用的甲酰胺溶液具有高毒性，应小心操作。使用后需洗手，并按照所在机构的指南进行废弃处理。
使用 Peak Scanner 软件读取荧光片段分析（FLA）结果可能具有挑战性。科罗拉多州立大学（CSU）已建立了一套基本的等位基因判读标准（串联重复次数）（表4-7）。需要注意的是，表4-7 所列范围可能并不完全涵盖所有情况。随着对其他 M. leprae 菌株的研究，可能会发现拷贝数超出表中所列范围的等位基因。其中一个特别的挑战是“影子峰”（stutter peaks）。这类峰通常表现为一系列峰簇，尤其常见于仅包含2-3个碱基对重复的短串联重复序列（STR），例如(TA)10。有时难以确定应读取哪一个峰（图7）。在该图中，阳性对照在190 bp处的峰为主峰；比主峰低、且长度比主峰大或小2、4甚至6个碱基对的峰被称为“影子峰”。A加尾（A-tailing）也可能造成判读困难，其现象在正文前文及图8中已有描述。最后，若PCR产物在样本中含量过高，峰形可能出现双峰现象。此时应以峰形的中心位置进行判读（参见图6，患者6）。
对于此类工作而言，数据管理可能是一项艰巨的任务。记录所有实验的相关信息至关重要，例如：操作或实验步骤的日期、操作人员、条带/孔板布局图、荧光分析（FLA）订单、PCR 条件与配方、凝胶及照片的拍摄日期、储存温度、DNA 模板稀释倍数、FLA 电子文件的存储位置等。良好的组织与数据管理能够节省未来查找特定信息所需的大量时间。
本文所述的实验室工作已在科罗拉多州立大学及全球其他多个地点持续开展了数年。所有收集数据的整体意义及其未来可能的应用价值正逐渐显现。图10A和10B展示了这些DNA指纹如何用于区分不同国家之间的M. leprae菌株（10A），甚至区分不同家庭之间的菌株（10B）。已有研究表明，与家庭和社区相关的病例携带的M. leprae具有相似或相同的VNTR菌株类型。人们希望，未来可能进一步揭示麻风病传播途径的机制，从而为高风险人群建立传播网络的早期检测系统，并在发生永久性神经和皮肤损伤之前启动治愈性药物治疗。

使用可变数目串联重复序列（vntr）- 片段长度分析（fla）对mycobacterium leprae菌株进行dna指纹图谱分析

DNA Fingerprinting of Mycobacterium leprae Strains Using Variable Number Tandem Repeat (VNTR) - Fragment Length Analysis (FLA)

由于麻风病的致病因子 Mycobacterium leprae无法在实验室中培养，因此研究其传播方式尤为困难。细菌的唯一来源是麻风病患者，以及实验感染的犰狳和裸鼠。因此，现代流行病学中常用的许多研究方法均不适用于麻风病的研究。尽管世界卫生组织（WHO）已实施了广泛的全球药物治疗计划1，麻风病仍在许多国家呈地方性流行，每年约有25万例新发病例2。M. leprae的全基因组已被测序3,4，并已鉴定出多个含有两个或以上碱基对重复片段的位点（称为微卫星和小卫星）5。临床分离的M. leprae菌株在多个此类位点上的串联重复片段数目（短串联重复序列，STR）可能存在差异5,6,7。可变数目串联重复序列（VNTR）5分析已被用于区分不同麻风杆菌菌株。某些位点似乎比其他位点更稳定，重复次数变异较小，而另一些位点则变化较快，有时甚至在同一患者体内也会发生变化。尽管某些VNTR的变异性引发了关于其是否适用于菌株分型的争议7,8,9，但新近的数据表明，分析多个在稳定性上具有差异的位点，可作为有价值的流行病学工具。多位点VNTR分析（MLVA）10已被用于研究包括中国11,12、马拉维8、菲律宾10,13和巴西14在内的多个国家的麻风病进化与传播。MLVA包含多个步骤：首先，从临床活检组织或皮肤刮片（SSS）中提取细菌DNA及宿主组织DNA10；然后通过聚合酶链式反应（PCR）扩增目标位点。每次反应使用针对4-5个不同位点的荧光标记引物，共四次反应可扩增18个位点10。PCR产物可经琼脂糖凝胶电泳检测，以确认目标DNA片段的存在，随后进行毛细管电泳荧光片段长度分析（FLA）。已知各重复位点拷贝数的犰狳传代细菌DNA被用作阳性对照。随后使用Peak Scanner软件分析FLA色谱图，并将片段长度转换为VNTR拷贝数（等位基因）。最后，分析VNTR单倍型的模式，结合患者的临床资料，可用于追踪菌株类型的分布情况。

由Mycobacterium leprae引起的麻风病在许多地区仍呈地方性流行。为了了解麻风病的传播方式和传播途径，确定患者感染的是哪种M. leprae菌株至关重要。可变数目串联重复序列（VNTR）分型即为此类方法之一。

使用可变数目串联重复序列（VNTR）- 片段长度分析（FLA）对Mycobacterium leprae菌株进行DNA指纹图谱分析

麻风病传播研究尤为困难，因为其致病菌——麻风分枝杆菌（Mycobacterium leprae）——无法在实验室中进行培养。

本实验的总体目标是从临床样本中直接获得麻风分枝杆菌（Mycobacterium leprae）——一种不可培养的麻风病致病菌——的独特DNA指纹图谱。从患者活检组织中提取的M. leprae细菌DNA，通过使用针对可变数目串联重复（VNTR）位点的荧光引物进行多重PCR扩增。DNA扩增完成后，采用毛细管电泳进行片段长度分析。通过分析数据来确定每个位点上短串联重复DNA片段的数量。由于EPRI的不同菌株在每个位点上的串联重复次数各不相同，因此多个位点的数据可产生独特的DNA指纹图谱，并可利用该技术建立患者菌株类型的数据库。通过分析特定社区内及全球范围内患者之间麻风病的种群结构、进化关系和传播模式，可为麻风病的消除提供遗传学工具和科学证据。该方法可用于追踪麻风病的传播路径，识别近期感染聚集病例和高风险个体，并评估防控项目的有效性。演示本实验操作的人员包括我实验室的研究人员 Lee 和 Ron Jensen，以及仪器核心设施的 Jason Rivers。使用标准的 KaiGen DNA 提取试剂盒从临床活检样本中提取 DNA。获得DNA后，在洁净的PCR操作柜内设置新的工作区域。为避免DNA污染，使用70%乙醇擦拭操作柜和一套移液器，并将操作柜和移液器置于紫外灯下照射15分钟。操作柜清洁完毕后，可开始配制多重PCR反应体系，每个多重PCR反应包含四到五对引物，其中每对引物中的一条带有荧光标记。必须进行混合。使用TE缓冲液配制的10微摩尔引物储备液来制备引物混合物：在同一个离心管中加入等量的所有正向（或上游）引物，使终浓度达到2微摩尔。根据需要，为每种引物补充TE缓冲液。另取一个八联管，以相同方式混合所有反向引物或下游引物。引物混合物制备完成后，配制PCR MES混合液。制作一张板图，标注每个样本及其对应的对照。混合液中应包含12微升KaiGen多重PCR混合液、每种引物混合液各2微升以及2微升Q溶液。务必配制足量的混合液，以包括对照反应并补偿移液过程中的损耗。将混合液短暂离心。接下来，将18微升主混合液分装到PCR板的每个孔中。为避免污染DNA样本，请更换手套，擦拭并消毒另一台生物安全柜。与之前相同，在通风橱完成去污染后，将PCR板转移至该通风橱内。然后向每个含有主混合液的孔中加入2 µL DNA样本。务必使用防气溶胶的移液器吸头以避免交叉污染。仔细密封PCR板，并短暂离心以混匀内容物。然后将反应板放入热循环仪中，并启动用于提交样品的PCR程序。对于FLA，准备甲酰胺尺寸标准品、主混合液，并将稀释后的PCR产物加入洁净的微量离心管中，每份待测样品加入12微升高纯度甲酰胺溶液和0.3微升GeneScan™ 500 LIZ®尺寸标准品。将上述溶液每孔分装12.3微升至96孔光学级反应板中。PCR 完成后，将反应板离心。务必记录每个样品在板图上的位置。然后在另一个 96 孔板中，每孔加入 59 微升无核酸酶水，并向每孔加入 1 微升 PCR 反应产物，使扩增的 DNA 按 1:60 的比例稀释。DNA稀释后，使用多通道移液器将每种稀释后的PCR样品各取一微升，转移至含有甲酰胺松散溶液的对应孔板中。程序完成后，可通过标准琼脂糖凝胶电泳检测样品，以确认在此阶段已扩增出预期大小的DNA片段。在使用FLA遗传分析仪进行荧光毛细管电泳分析前，需对样品进行分析前准备：向孔板加装隔垫，短暂离心以去除气泡，并使样品沉入孔底。IDE 溶液将通过化学方式使DNA链变性，因此无需加热变性。将样品板放入上样托盘中。使用毛细管电泳方法（如ABBI'S遗传分析仪3130 xl）对标记的PCR产物进行分析。使用填充了POP7聚合物作为分离介质的50厘米毛细管对样品进行分析。DNA在毛细管中迁移至末端，由激光和检测器测量荧光标记，打开分析仪的采集软件。在运行样品前，需对分析仪进行校准，以检测所有使用的染料，包括作为大小标准的ABIs G5。这些样品采用电激进进样，条件为1.6千伏，持续15秒。通过施加15千伏电压持续1800秒来分离片段。每次运行的总运行时间约为45分钟。运行结束后，为每个样品创建数据文件。文件由分析仪的采集软件放置在预定位置的板文件夹中。文件格式为 FSA。FLA 数据可使用峰图扫描软件进行分析，该软件可在 Applied Biosystems 网站免费获取。要分析数据，请点击“开始新项目”，然后点击“添加文件”。将选定的数据文件加载到程序中，包括阳性和阴性对照。选择并分析已加载的文件。结果以FLA色谱图形式呈现。大小标准品显示为橙色峰，而彩色峰则代表样本中每个分析位点的细菌DNA样本，单击峰可确定其碱基对大小。由于DNA聚合酶滑链合成，某些微卫星位点会检测到一系列相同颜色的峰。在这些情况下，通常选择幅度最大的峰。将每个样本中的片段大小与阳性对照的大小进行比较，以确定所检测的每个等位基因包含的串联重复片段数量，并将数据记录到 Excel 电子表格中以供进一步分析。在本图中，显示了来自同一村庄三个不同家庭的七位患者的分离株的 DNA 指纹图谱，并标明了所分析的每个多态性位点的串联重复次数。这些数据表明，B 家族中有两名成员感染了相同的菌株，而另一名成员感染了不同的菌株。C 家族的成员很可能感染了相同的菌株，A 家族的成员也是如此。观看本视频后，您应能够充分理解如何在临床上对麻风病患者常规采用多重 PCR 和片段长度分析，以获得其 V-N-T-R-D-N-A 指纹图谱。这些是用于补充麻风病防控传统流行病学的新型分子工具。

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