重新接种来自人多能干细胞的分化神经元

0 次观看4:20 分钟 • July 8th, 2025

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从一个大的培养板开始,该培养板含有具有密集神经元网络的人多能干细胞衍生的分化神经元。

这些神经元与温和的蛋白水解酶一起孵育,以将它们从板上分离出来,将它们提起为片状。

随着持续孵育,酶会部分破坏细胞连接,使神经元网络松动。

添加培养基以停止酶活性。

反复移液分离的神经元以将它们彼此分离。

通过细胞过滤器过滤神经元以去除细胞团块并收集单个神经元。

心并除去上清液。将它们重悬于生长培养基中。

为了重新电镀,将这些神经元接种到聚合物和粘附蛋白包被的多孔板上。孵化以允许它们附着。

神经元利用培养基中的营养物质来保持活力。定期更换培养基以保持营养水平。

进一步孵育以使神经元成熟并形成它们之间的连接。

首先用PBS轻轻冲洗分化神经元板。将PBS分散到板壁上,而不是直接分散到细胞上,以避免破坏它们。在倾斜时从培养皿边缘吸出PBS,注意不要接触细胞。

每10厘米板至少施用1毫升蛋白水解酶,并将细胞放回培养箱40至45分钟。在孵育过程中,在相差显微镜上检查神经元,并继续蛋白酶处理,直到神经网络完全从板上分离并开始破裂。当神经元分离时,通过每 1 毫升蛋白酶添加 5 毫升新鲜 DMEM 培养基来停止消化。

使用血清移液器将细胞在板上轻轻研磨 5 至 8 次,确保不要施加太大的压力。通过 100 微米网将细胞逐滴过滤到 50 毫升锥形管中,并用额外的 5 毫升新鲜 DMEM 培养基冲洗过滤器。

使用台式离心机以 1,000 倍 g 将细胞旋转 5 分钟。离心后,将锥形管放回生物安全柜并吸出大部分培养基,留下 250 微升以保持细胞湿润。将细胞轻轻重悬于 2 毫升新鲜 DMEM 培养基中,并将它们通过 5 毫升血清移液器的末端。

最后,将管子倒置 2 到 3 次。使用血细胞计数器和台盼蓝计数活细胞,然后用新鲜的DMEM将细胞稀释至所需浓度。根据特定细胞系的要求向试管中添加适当的补充剂,并通过倾斜锥形管 2 至 3 次轻轻混合细胞。

从 24 孔板中吸出层粘连蛋白涂层,并用 PBS 冲洗一次。吸出PBS并以8字形运动将细胞溶液涂在每个孔上,以避免结块。完成细胞铺板后,将板放回设置为 37 摄氏度和 5% 二氧化碳的培养箱中。

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最后更新:1 八月 2026