利用微流控芯片开发人诱导多能干细胞来源的运动神经类器官

在含有 Rho 激酶抑制剂的营养丰富的干细胞培养基中培养人诱导性多能干细胞（iPSCs）。

抑制剂进入细胞并阻断Rho激酶，防止细胞凋亡。

细胞利用营养物质增殖，并自发聚集形成一种称为球状体的三维细胞簇。

逐渐将培养基更换为神经诱导培养基。培养基中的信号调节分子可促进干细胞向神经细胞分化。

更换为富含生长因子的神经培养基，以诱导类球体细胞分化为运动神经元，并形成运动神经元类球体（MNS）。

将这些MNS转移至含有成熟培养基的聚合物包被的微流控芯片中。

培养基中的神经生长因子可刺激神经元的轴突或较长突起从类球体中生长出来，并通过芯片中的微通道延伸。

这形成了一个运动神经类器官，即运动神经组织的三维模型。

为诱导3D iPS细胞分化为运动神经元，将4 × 10⁴个iPS细胞接种至96孔U型底培养板的每个孔中，每孔体积为100微升，培养基为无饲养层且无血清的细胞培养基，并添加10微摩尔Y27632。

第二天，将每孔中的上清液更换为 100 微升添加了 10 微摩尔 SB-431542 和 100 纳摩尔 LDN-193189 的 KSR 培养基。在第 2 天和第 3 天，将上清液更换为 100 微升添加了 10 微摩尔 SB-431542、100 纳摩尔 LDN-193189、5 微摩尔 DAPT、5 微摩尔 SU-5402、1 微摩尔视黄酸和 1 微摩尔 smoothened 激动剂的 KSR 培养基。在第 4 天和第 5 天，将上清液更换为 75% KSR 培养基与 25% N2 培养基的混合液，并添加 10 微摩尔 SP-431542、100 纳摩尔 LDN-193189、5 微摩尔 DAPT、5 微摩尔 SU-5402、1 微摩尔视黄酸和 1 微摩尔 smoothened 激动剂。

在第6天和第7天，将上清液更换为50% KSR培养基与50% N2培养基的混合液，其中添加5微摩尔DAPT、5微摩尔SU-5402、1微摩尔视黄酸和1微摩尔smoothened激动剂。在第8天和第9天，将上清液更换为25% KSR培养基与75% N2培养基的混合液，其中添加5微摩尔DAPT、5微摩尔SU-5402、1微摩尔视黄酸和1微摩尔smoothened激动剂。在第10天和第11天，将上清液更换为N2培养基，其中添加5微摩尔DAPT、5微摩尔SU-5402、1微摩尔视黄酸和1微摩尔smoothened激动剂。在第12天，将每孔中的上清液更换为100微升成熟培养基，每孔添加20纳克/毫升脑源性神经营养因子。

为诱导运动神经类器官形成，将PDMS芯片中的包被溶液替换为150微升添加了20纳克/毫升脑源性神经营养因子的成熟培养基，并使用宽口微量移液吸头轻轻将96孔板中一个孔内的运动神经球状体加入芯片微通道的入口。在培养皿中靠近组织培养芯片的位置放置一小 reservoir 的无菌水，以防止培养基蒸发，然后将培养皿置于37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中。

每两到三天，从培养基储液池中央更换一半的耗尽培养基，补充含有20纳克/毫升脑源性神经营养因子的新鲜成熟培养基。轴突将从运动神经元球体生长进入微通道，并在两到三周内自发组装成单一束状结构，形成运动神经类器官。