从小鼠胚胎干细胞生成皮层中间神经元前体细胞

取悬浮于含小分子抑制剂的无血清培养基中的小鼠胚胎干细胞。

将细胞接种于非黏附性培养板上，使其增殖并聚集形成三维的胚胎样小体（embryoid bodies，EBs）。

此外，这些抑制剂可阻断非神经元信号通路，并诱导胚胎干细胞向皮层神经细胞命运分化。

将EBs转移至离心管中，离心并移除上清液。

将拟胚体重悬于含有酶混合液和DNase的溶液中。

酶将EBs解离为单细胞，同时DNase降解污染的DNA。

加入含抑制剂的无血清培养基以终止酶活性，然后离心并移除含有酶的上清液。

将细胞重悬于含有小分子抑制剂的培养基中，并接种至包被有黏附因子的培养板上。

细胞附着在包被的培养板表面。

这些抑制剂可阻止细胞凋亡，并诱导细胞分化为皮层中间神经元前体细胞。

以每毫升75,000个细胞的密度将细胞接种于非黏附性组织培养皿中的KSRN2培养基中，开始以拟胚体形式培养细胞，并在37摄氏度条件下孵育。在分化第1天（DD1），通过用多聚-L-赖氨酸在37摄氏度下包被组织培养处理过的培养皿至少1小时或过夜，为细胞贴壁做好准备。

在DD2，吸除多聚赖氨酸，然后在37摄氏度下用层粘连蛋白对培养板包被过夜。在DD3，开始EB解离前，吸除层粘连蛋白，并将培养板置于组织培养罩内彻底干燥。

随后，将EBs连同培养基转移至15毫升离心管中，在15 × g 条件下离心3至4分钟，或直至EBs完全沉淀。吸除培养基，并加入3毫升含有DNase的细胞解离溶液。然后，将样品在37°C下孵育15分钟。

每三分钟轻轻弹击离心管一次，以促进拟胚体解离。当拟胚体不再可见或已达到15分钟时，加入6毫升含DNase的KSRN2培养基，于200 × g离心5分钟。 g. 然后，将细胞接种于含有LDN193189、XAV939和ROCK抑制剂Y27632的KSRN2培养基中，细胞密度为4.5至5 x 10⁴ 每平方厘米细胞数