分离由成人人类成纤维细胞衍生的诱导性神经前体细胞克隆

从成人人类成纤维细胞衍生的诱导性神经祖细胞集落在经层粘连蛋白包被的多孔板中进行贴壁培养开始。 

用缓冲液洗涤菌落以去除非黏附细胞，然后加入新鲜缓冲液。

刮取单个菌落周围以去除周围的细胞。

将细胞集落转移至含有神经诱导培养基的新鲜层粘连蛋白包被孔中。

通过机械法解离菌落，以获得单细胞悬液。

层粘连蛋白是一种细胞外基质蛋白，可与前体细胞的表面蛋白相互作用，促进细胞黏附于培养孔表面。

加入一种可进入细胞并阻断特定蛋白激酶的小分子抑制剂，以防止细胞凋亡。

神经诱导培养基中的生长因子和小分子可促进前体细胞的增殖。

定期更换培养基以补充营养，促进前体细胞持续增殖。

融合培养物，或完全覆盖的细胞层，表明诱导神经前体细胞成功扩增。

一天后，吸出培养板中的层粘连蛋白，并向每个孔中加入 200 微升神经诱导培养基。在向六孔板每孔加入 2 毫升神经诱导培养基之前，用 DPBS 将待挑选克隆的六孔板洗涤一次。

使用细针刮除克隆周围细胞以机械方式挑选细胞，并用安装在设定为50微升的200微升移液器上的吸头吸取克隆。

将每个菌落转移至经层粘连蛋白包被的48孔板中的一个孔内，并通过上下吹打10次，机械法制成单细胞悬液。向细胞中加入Rho激酶抑制剂，终浓度为10微摩尔。将细胞置于37摄氏度、5% CO₂条件下，在48孔板中培养两天。每隔两天更换一次培养基，直至细胞达到80%至90%汇合度。