人神经母细胞瘤细胞系向成熟神经元的分化

从含有神经元样细胞和上皮样细胞的未分化神经母细胞瘤细胞系开始，在高血清浓度培养基中进行培养。

移除培养基，加入含有较低血清浓度并补充了视黄酸的分化培养基。

血清剥夺可抑制类上皮细胞的增殖。

视黄酸可诱导类神经元细胞中神经元基因的表达，使其转变为更分化的表型。

加入胰蛋白酶-EDTA 混合液以解离部分分化的细胞。

加入含有血清蛋白的培养基以阻断胰蛋白酶。

接种细胞，并加入含有视黄酸和进一步降低血清浓度的新鲜分化培养基。

细胞继续发育出延伸的突起。

加入胰蛋白酶以消化细胞。

接着，加入培养基以终止胰蛋白酶作用，并将细胞接种至包被有细胞外基质蛋白的培养皿中，以促进细胞黏附。

最后，加入含有神经元生长因子的无血清培养基。

这些因子可诱导终末分化，形成具有广泛分支突起的成熟神经元。

在第0天，使用血细胞计数板对细胞进行计数。然后，用基础培养基将细胞悬液稀释至每毫升50,000个细胞。每35毫米培养皿中接种2毫升细胞悬液，即每皿共100,000个细胞。随后，将细胞置于37°C培养箱中培养。

第一天，将视黄酸（RA）加入预热并平衡好的培养基中。轻轻吸去旧培养基并弃去。随后，向每个35毫米培养皿中加入2毫升含视黄酸的分化培养基一，然后放回培养箱中。

第7天，轻柔地吸除旧的培养基并弃去。向每个35毫米培养皿中加入200微升预热的胰蛋白酶-EDTA溶液。然后将细胞放入培养箱中孵育2至3分钟，或直至在显微镜下观察到细胞明显从培养皿表面脱落。

通过向每个35毫米培养皿中加入2毫升含RA的分化培养基一号来终止胰蛋白酶反应，并用该培养基冲洗培养板上残留的神经元细胞。随后，将全部液体转移至50毫升锥形管中。

用10毫升塑料移液管轻柔地缓慢吹打5次以内。随后，将2毫升细胞悬液分装至新的35毫米培养皿中，并放回培养箱。

第10天，轻柔地吸去培养基并弃去。向每个35毫米培养皿中加入200微升预热的胰蛋白酶，于室温孵育约1至2分钟，或直至在显微镜下观察到神经元明显从培养皿表面脱离为止。

第10天的实验步骤尤为困难，因为细胞在此分化阶段极为敏感。必须将细胞在胰蛋白酶中的处理时间缩短至室温下约一分钟，并立即放回培养箱中。

然后，通过向每个35毫米培养皿中加入2毫升分化培养基二号来终止胰蛋白酶消化，并用该培养基冲洗培养板上残留的神经元细胞。随后，将内容物转移至50毫升锥形管中。用10毫升塑料移液管轻柔地缓慢吹打重悬，不超过5次。将2毫升细胞悬液分装至经ECM包被的35毫米培养皿中，然后放回37摄氏度的培养箱中继续培养。

第11天，轻柔地吸除旧的培养基并弃去。随后，向每个35毫米培养皿中缓慢加入2毫升含视黄酸的分化培养基三号，然后将培养皿放回培养箱中。

第18天，每隔三天将培养基更换为新鲜的含视黄酸的分化培养基三号，以维持神经元的健康状态。切勿使神经元长时间暴露于空气中。