0 次观看 • 7:03 分钟 • July 8th, 2025
首先，在涂有赖氨酸的培养皿中组装包含微通道的微流控装置。
将胚胎神经元与生长培养基一同接种至微流控芯片的微孔中，使其流经微通道。
孵育以促进神经元黏附和生长，形成物理隔离的神经元群体。
拆解装置，将培养皿放入带有盐溶液流动的显微操作 chamber 中，以维持细胞活性。
将赖氨酸包被的微珠引入神经元附近，使神经突或细胞突起附着并形成微珠-神经突复合物。
使用显微操作器，施加负压以捕获一个通道中的珠-神经突复合物。
拉动该复合物以诱导机械张力，从而实现快速的神经突延伸。
将此导向另一个珠-神经元复合体，并用第二个显微操作器固定。
保持两种珠子的位置不变，以促进神经突连接的形成。
释放负压，将生理盐水替换为培养基。
孵育以建立神经元之间的功能性连接，促进通过神经递质进行的通讯。
从微流控装置的上层孔中移除培养基，但不要将孔排空。然后，向微流控装置的右上孔中加入 20 微升浓缩的细胞溶液，并在显微镜下观察细胞在单一群体微流控装置内的流动情况。
将浓缩的细胞溶液各20微升加入多细胞群体装置的每个上层孔中，以进行细胞接种。在显微镜下检查细胞是否已进入腔室。随后，将装置放入培养箱中孵育15至30分钟，以促进细胞贴附于基质表面。
待细胞贴附于基质后，向单一群组装置的上方两个孔中各加入40微升NBM，以帮助去除微通道中的气泡。向多群组装置的上层孔中加入20微升NBM，即之前接种细胞的同一孔。培养基应略微凸出，形成正弯月面，使孔内液体呈现类似松饼顶部的隆起外观。
在移除微流控装置前一至两天，向每个样品皿中加入 2 毫升预热的 NBM，并充满各个腔室。随后将装置置于培养箱中继续孵育。接着，使用无菌镊子和移液器吸头从盖玻片上移除微流控装置，留下呈图案化排列的神经元。
在此步骤中，向细胞培养物中加入40至60微升已制备的PDL包被微珠。然后将样品放回培养箱中孵育一小时，以促进突触连接的形成。随后，将样品安装至实验装置中，使细胞可从上方通过两根微电极进行检测，同时可进行光学观察。在此配置下，显微镜的侧端口安装有CCD相机用于图像采集。将每根充满生理盐水的微电极连接至1毫升注射器，然后用生理盐水溶液对样品进行灌流。
接下来，在显微镜下检查两个分离的神经元群体之间的间隙，以确保这两个群体未发生自然连接。选择一个视野中未与神经元连接的PDL微珠。通过先聚焦于微珠，再聚焦于微移液管尖端，将微珠与微移液管尖端对齐。
随后，通过显微镜观察，将移液尖端尽可能靠近微珠。然后对移液管施加负压以吸附微珠，并在整个实验过程中保持负压。
现在，选择视野中附着于神经元的PDL微珠，通过负压将其固定在第二根微移液管上。通过以每分钟0.5微米的速度缓慢移动显微操作器或样品载物台1微米，牵拉PDL微珠-神经元复合物，随后暂停五分钟，以允许神经突起始。
以每分钟0.5微米的速度，横向移动PDL珠-神经元复合物2微米，从而牵拉该复合物。随后暂停5分钟，以允许神经突延伸。在成功启动并实现前5微米的神经突延伸后，以每分钟20微米的速度持续牵拉神经突。
为了连接神经元，选择一个富含神经突的区域。利用其他微珠来评估移液管尖端相对于盖玻片的高度，并降低PDL微珠-神经突复合物，使其与神经突发生物理接触。在操作第二根微移液管时，保持PDL微珠-神经突复合物与目标神经突接触。然后，将带有第二个PDL微珠的第二根移液管下降至新形成的神经突上方，位置距离第一个微珠约20微米，并利用第二个PDL微珠将新生的神经突纤维推向目标细胞。
接下来，将两个珠子固定至少一小时。使用显微镜检查是否存在局灶性肿胀，即与珠子接触的神经突出现增厚的现象。在此期间，缓慢将样品的培养基从生理盐水中更换为预热并经二氧化碳平衡的NBM。
通过释放吸力使第二支移液器中的珠子脱离。如果新生的神经突仍保持连接，则同时释放第一支移液器的固定速度。随后，小心将样品放回培养箱中，以增强神经元连接，为后续实验做准备。