启动快速神经突延伸及功能性神经元连接的形成

首先，在涂有赖氨酸的培养皿中组装包含微通道的微流控装置。

将胚胎神经元与生长培养基一同接种至微流控芯片的微孔中，使其流经微通道。

孵育以促进神经元黏附和生长，形成物理隔离的神经元群体。

拆解装置，将培养皿放入带有盐溶液流动的显微操作 chamber 中，以维持细胞活性。

将赖氨酸包被的微珠引入神经元附近，使神经突或细胞突起附着并形成微珠-神经突复合物。

使用显微操作器，施加负压以捕获一个通道中的珠-神经突复合物。

拉动该复合物以诱导机械张力，从而实现快速的神经突延伸。

将此导向另一个珠-神经元复合体，并用第二个显微操作器固定。

保持两种珠子的位置不变，以促进神经突连接的形成。

释放负压，将生理盐水替换为培养基。

孵育以建立神经元之间的功能性连接，促进通过神经递质进行的通讯。

从微流控装置的上层孔中移除培养基，但不要将孔排空。然后，向微流控装置的右上孔中加入 20 微升浓缩的细胞溶液，并在显微镜下观察细胞在单一群体微流控装置内的流动情况。

将浓缩的细胞溶液各20微升加入多细胞群体装置的每个上层孔中，以进行细胞接种。在显微镜下检查细胞是否已进入腔室。随后，将装置放入培养箱中孵育15至30分钟，以促进细胞贴附于基质表面。

待细胞贴附于基质后，向单一群组装置的上方两个孔中各加入40微升NBM，以帮助去除微通道中的气泡。向多群组装置的上层孔中加入20微升NBM，即之前接种细胞的同一孔。培养基应略微凸出，形成正弯月面，使孔内液体呈现类似松饼顶部的隆起外观。

在移除微流控装置前一至两天，向每个样品皿中加入 2 毫升预热的 NBM，并充满各个腔室。随后将装置置于培养箱中继续孵育。接着，使用无菌镊子和移液器吸头从盖玻片上移除微流控装置，留下呈图案化排列的神经元。

在此步骤中，向细胞培养物中加入40至60微升已制备的PDL包被微珠。然后将样品放回培养箱中孵育一小时，以促进突触连接的形成。随后，将样品安装至实验装置中，使细胞可从上方通过两根微电极进行检测，同时可进行光学观察。在此配置下，显微镜的侧端口安装有CCD相机用于图像采集。将每根充满生理盐水的微电极连接至1毫升注射器，然后用生理盐水溶液对样品进行灌流。

接下来，在显微镜下检查两个分离的神经元群体之间的间隙，以确保这两个群体未发生自然连接。选择一个视野中未与神经元连接的PDL微珠。通过先聚焦于微珠，再聚焦于微移液管尖端，将微珠与微移液管尖端对齐。

随后，通过显微镜观察，将移液尖端尽可能靠近微珠。然后对移液管施加负压以吸附微珠，并在整个实验过程中保持负压。

现在，选择视野中附着于神经元的PDL微珠，通过负压将其固定在第二根微移液管上。通过以每分钟0.5微米的速度缓慢移动显微操作器或样品载物台1微米，牵拉PDL微珠-神经元复合物，随后暂停五分钟，以允许神经突起始。

以每分钟0.5微米的速度，横向移动PDL珠-神经元复合物2微米，