建立人源血脑屏障的三重细胞共培养模型

首先将周细胞接种到小室插入膜的下表面。

用培养板覆盖小室插入物，并进行孵育。

周细胞附着于培养板插件的膜上，形成单层细胞或单层结构。

取另一块培养皿。

在合适的培养基中将人星形胶质细胞加入孔板中。然后，孵育培养板。

星形胶质细胞附着在孔板底部并形成单层。

弃去培养基，加入新鲜的星形胶质细胞和周细胞培养基。

现在，取含有带周细胞层的孔插件的培养板。

倒置培养板，将小室插入含有星形胶质细胞层的孔中。

将人脑微血管内皮细胞加入到小室插入膜的上层，并进行孵育。

内皮细胞附着于培养板小室上，形成一种类似于血脑屏障的三重细胞共培养系统，该屏障是分隔血液与大脑的关键界面。

首先，在37°C、5%二氧化碳培养箱中，使用具有促进细胞贴壁活性表面的T75培养瓶培养HBVP细胞，直至细胞汇合。达到汇合状态后，吸除旧的寄生虫培养基，并用5毫升预热的Dulbecco's PBS洗涤细胞。吸除Dulbecco's PBS，然后使用4毫升预热的胰蛋白酶-EDTA溶液与1毫升Dulbecco's PBS的混合液将细胞从培养瓶上消化下来。

将锥形瓶置于二氧化碳培养箱中，在 37 摄氏度下孵育 5 分钟。在显微镜下观察，以确认细胞是否已从瓶壁脱落。向锥形瓶中加入 5 毫升含 2% FBS 的预温寄生虫培养基，将脱落的细胞转移至 50 毫升离心管中。将细胞悬液在 200 g 条件下离心 3 分钟，使细胞在管底形成沉淀。

从离心管中吸弃培养基，确保细胞沉淀保持完整。将细胞沉淀重悬于寄生虫培养基中。根据细胞汇合度及所需插入式培养板的数量，计算所需培养基的体积。取10 µL重悬的细胞悬液，加入细胞计数载玻片中，计数细胞数量。

确定细胞密度，并将300,000个细胞接种到每个小室的管腔侧，每孔加入1毫升寄生虫培养基。按照文本手稿中的描述，使用含2% FBS的星形胶质细胞培养基培养原代人星形胶质细胞。确定细胞密度，并将300,000个细胞接种至组织培养6孔板的孔底，每孔接种一个。盖上培养板以防止蒸发，并过夜培养。

从培养箱中取出含有星形胶质细胞的组织培养6孔板，其中小室中含周细胞。吸去组织培养6孔板中的星形胶质细胞培养基，每孔加入1毫升寄生虫培养基和1毫升星形胶质细胞培养基。

吸弃微孔插件中的周细胞培养基，将其放入已接种星形胶质细胞的组织培养6孔板中。在相同微孔插件的顶端侧，用2毫升完全经典培养基以每孔300,000个细胞的密度接种HBMEC。