一种基于透明质酸的水凝胶用于胶质母细胞瘤细胞的三维培养

从胶质瘤球开始，即来源于脑肿瘤或胶质母细胞瘤的细胞聚集体。

加入解离酶。孵育以分离胶质母细胞瘤细胞，获得单细胞悬液。

接下来，加入富含血清的培养基以终止酶活性。

离心并移除上清液，然后重悬细胞。

过滤悬浮液，然后离心并弃去上清液。

将细胞重悬于含有小肽的水凝胶前体中。

将此混合物加入含有透明质酸的预组装硅胶模具的孔中。

混合溶液。孵育以促进透明质酸与水凝胶前体之间的相互作用，形成有利于细胞包埋的水凝胶。

加入培养基覆盖水凝胶，以维持细胞存活。

拆卸模具后，孵育水凝胶。

在水凝胶中，细胞上的黏附蛋白与前体肽和透明质酸相互作用。

这会导致细胞形成小的细胞簇并发展成三维培养物。

首先，将洁净干燥的硅橡胶模具放入未经组织培养处理的12孔板的每个孔中，并使用移液器吸头的洁净钝端将模具贴附于孔板底部。在检查模具与孔底之间的密封性后，通过离心收集胶质母细胞瘤细胞培养物中解离的胶质瘤球体，并将沉淀重悬于1毫升细胞解离酶中。

室温孵育五分钟后，轻轻敲击离心管以混匀，并加入4毫升完全培养基终止酶促反应。再次离心细胞，将沉淀重悬于1毫升新鲜完全培养基中，随后通过70 µm细胞滤网过滤。用额外的4毫升完全培养基冲洗滤网，然后将细胞悬液分装为两份，每份含8 × 10⁴ 个细胞，分别置于离心管中。

通过离心收集细胞，并将一份沉淀重悬于80 µL新鲜配制的聚乙二醇马来酰亚胺（PEG-Mal-RGD）中，另一份沉淀重悬于80 µL新鲜配制的PEG-Mal-CYS溶液中，每份对应一个模具。使用200 µL宽口移液枪头，向每个橡胶硅胶模具中加入40 µL透明质酸溶液，随后加入40 µL的PEG-Mal-CYS或PEG-Mal-RGD细胞悬液，快速吹打混合，每个模具吹打不超过10次。

由于凝胶化时间较快，一旦将两种水凝胶组分混合，必须使用宽口移液枪头快速而充分地混合溶液。此步骤需要练习。

然后，将包埋细胞的凝胶置于37摄氏度、5% CO₂ 的细胞培养孵箱中孵育5至10分钟。孵育结束后，向每个凝胶中加入2至2.5毫升培养基，使用无菌的2微升移液器吸头和镊子轻轻将凝胶从模具壁上分离。接着，用灭菌镊子将模具从培养板孔中取出，并将培养板放回细胞孵箱中。