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神经科学
0 次观看 • 5:12 分钟 • July 8th, 2025
从一只幼鼠的大脑开始。
分离小脑并获取适当厚度的组织切片。
将切片转移至置于培养板孔内含培养基的膜插件上。
在加药孔中，培养基含有神经保护性待测化合物；对照孔中不含该化合物。孵育。
在对照条件下，小脑浦肯野细胞发生凋亡，模拟出生后早期发育过程 体内
在处理过的孔中，根据该化合物的潜在作用，其可能保护细胞免于凋亡。
洗涤切片并进行固定以保持细胞完整性。
将切片转移至通透-封闭液中，以通透细胞膜并封闭非特异性结合位点。
使用靶向浦肯野细胞中特异性表达的钙结合蛋白的一抗进行孵育。
洗涤并加入针对一抗的荧光素标记二抗。
使用DNA结合染料对细胞核进行复染，并封片。
使用共聚焦显微镜定量可存活的浦肯野细胞，以确定受试化合物的神经保护潜力
为获取小脑，使用直头敷料镊夹住幼鼠头部的鼻部，用直头眼科剪从后端向外侧沿中线剪开头皮。以相同方式剪开颅骨，剪刀尖端朝外，以避免损伤小脑，然后使用刮勺将脑组织转移至含有冷HBSS和5毫克/毫升葡萄糖的60毫米培养皿中。
使用直头敷料镊小心分离出小脑，并用无菌弯头精细镊子将组织放置在切片机切片台的塑料圆盘上。旋转切片台以调整组织方向，以便获取旁矢状切面，然后将切片台释放旋钮向右拉动，移动切片台直至刀片位于组织边缘。接着，将切片厚度调整为 350 微米，刀片速度调至中等，启动切片机。当整个小脑完成切片后，关闭切片机。
使用无菌镊子将组织块置于新的 60 毫米培养皿上方。用移液管吸取含葡萄糖的 HBSS 冲洗组织块，使脑片落入培养皿中。随后，尽量减少对样本的接触，使用微探针将脑片分离。
使用移液管将靠近小脑蚓部的组织切片转移至六孔板中的各个细胞培养插件上，并用微探针将切片调整至每个插件的中央位置。所有切片放置完毕后，小心吸除多余的含葡萄糖 HBSS，然后将培养板放回细胞培养箱中。
进行免疫荧光染色时，吸除每孔中的上清液，并用 PBS 清洗插入式培养小室。每孔插入式培养小室中加入 1 毫升预冷的 4% 多聚甲醛进行固定，同时在每个插入式培养小室上方加入 500 微升，4°C 固定 1 小时。
固定结束后，在轨道摇床上用1毫升新鲜PBS洗涤插入物4次，每次10分钟，每次洗涤时在每个插入物下方加入1毫升新鲜PBS，上方加入500微升新鲜PBS。预先在24孔板的每个孔中加入500微升PBS-TB，并用画笔将每个细胞培养插入物中的小脑切片转移至24孔板的各个独立孔中。
室温下对切片进行通透和封闭处理，持续一小时。孵育结束后，在4摄氏度下于旋转摇床上用含目标一抗的PBS-TB溶液（每孔200微升）避光孵育过夜。
次日早晨，在摇床上用新鲜 PBS 洗涤切片，每次加入 500 µL，共洗涤四次，每次 10 分钟；随后在避光条件下，于室温下在摇床上用相应的荧光染料标记的二抗孵育两小时，对样本进行标记。
孵育结束后，在避光条件下，每孔加入500 µL适当的细胞核复染液，在室温下复染10分钟，并使用移液管将切片转移至载玻片上。
然后，让切片完全风干，再用 PBS 重新水化，并用覆盖约 80 微升封片剂的盖玻片封片。待封片剂固化后，即可对小脑切片进行成像。