从脑肿瘤细胞悬液中生成类器官培养物

从一个含有富含层粘连蛋白的细胞外基质（lrECM）的微量离心管开始。层粘连蛋白是大脑中大量存在的结构成分。

将试管置于冰上，以防止 IrECM 聚合。

加入脑肿瘤细胞并充分混匀，以确保细胞均匀分布。

接下来，将混合物转移至 Parafilm 模具上，形成液滴。

孵育以促进lrECM聚合形成支架，模拟细胞的天然环境。

现在，将凝固的类器官冲洗至含有培养基的培养皿中，然后进行培养。

培养基提供细胞分裂所需的营养物质和生长因子。

在类器官中，细胞通过迁移和侵袭实现自我组织。

孵育后，倾斜培养板以使类器官沉降。

小心移除多余的培养基，并加入新鲜培养基。

轻轻振荡孵育。

这可以均匀分布营养物质，并促进类器官生长。

为了从单细胞悬液中培养类器官，需将适量的富含层粘连蛋白的细胞外基质（lrECM）加入预冷的离心管中，置于冰桶或冷块上。

制备含有每个类器官20,000个细胞的细胞混合物。充分混匀lrECM细胞悬液混合物，以避免细胞沉降，否则会导致类器官形成不均一。接下来，小心地将20微升混合液用移液器滴加到帕拉膜模具上，形成珍珠状液滴。每制备两到三个类器官后，务必冷却移液器枪头，以防止lrECM发生聚合。

当将所需数量的类器官用移液器点样至10厘米培养皿中的石蜡膜模具上后，在细胞培养箱中37摄氏度孵育1至2小时。待类器官凝固后，使用P1000枪头以NBMC培养基轻轻冲洗，将类器官从石蜡膜模具上洗下，并收集至含有20毫升NBMC培养基的新10厘米培养皿中。将培养皿放入培养箱中静置培养4天。

培养4天后，更换培养板中的培养基。操作时，在细胞培养板下方放置一张深色纸。倾斜培养板并等待20秒，待类器官完全沉降至培养皿底部后，用大开口玻璃移液管缓慢吸除培养基。

加入新的培养基后，将培养板置于摇床式恒温培养箱中，转速为80 RPM，此后每2至3天更换一次培养基。