Name: 颅放疗引起的认知功能障碍恢复干细胞移植策略 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: 了解颅放疗后干细胞移植恢复认知功能的方法，通过向无胸腺大鼠海马区移植人神经干细胞，建立可重复的精准注射与立体定向放疗方案，为脑肿瘤患者认知障碍治疗提供研究框架。

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本研究工作获得了美国国立卫生研究院神经疾病与中风研究所（NIH NINDS）资助 R01 NS074388 581（C.L. Limoli）、加州再生医学研究所（CIRM）资助 RS1-00413（C.L.L.）、CIRM 培训资助 TG2-0115（M.M.A.）以及 CIRM 为支持视频记录工作向 JOVE 提供的资助。

我们的实验方案如图1所示。
1. 用于移植的人类神经干细胞（NSCs）的培养与制备
<ol>
	<li>本研究使用了 EnStem-A 细胞系（EMD Millipore）。神经干细胞（NSCs）由生产商常规验证，具有高水平表达多能性标志物 nestin 和 Sox2，低水平表达多能性标志物 Oct-4，并具备分化为多种神经表型的能力以及在多次传代后维持正常核型的特性。在我们的培养条件下，这些神经干细胞表现出 Sox2 和 nestin 的高表达，并保留了分化能力，如先前所述1。神经干细胞培养于经多聚-L-鸟氨酸（20 μg/ml）和层粘连蛋白（5 μg/ml）包被的组织培养处理过的培养瓶中。细胞在神经扩增培养基（Millipore）中培养，添加 L-谷氨酰胺（2 mM）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF；20 ng/ml）。贴壁的单层神经干细胞每隔一天（1:2）使用 accutase 作为解离试剂进行传代1。用于移植研究的神经干细胞均在第10代以内使用。</li>
	<li>通过在移植前3天向生长培养基中添加 4 μM BrdU，对神经干细胞进行 5-溴-2'-脱氧尿苷（BrdU）标记。为验证 BrdU 标记指数（即 BrdU 阳性细胞的百分比），将细胞接种于腔室载玻片上，并采用标准免疫细胞化学方法检测 BrdU。用于移植的细胞通常显示标记指数超过 90%2。此外，移植的人源干细胞也可通过人特异性核抗原标志物（HuNu）进行检测2。</li>
	<li>移植当天，将 accutase 和神经扩增培养基置于 37°C 水浴中预热。细胞在孵育培养基（含 10 μM Y-27632 的神经扩增培养基）中孵育1小时。Y-27632（ROCK 抑制剂，EMD-Calbiochem）用于提高神经干细胞移植后的存活率。</li>
	<li>孵育1小时后，移除孵育培养基，细胞用 accutase 处理5分钟。短暂处理后，加入等体积的神经扩增培养基以中和 accutase，并通过 70 μM 细胞滤网过滤细胞。</li>
	<li>使用血细胞计数板计数细胞，并以注射培养基（含 10 μM Y-27632、40 ng/ml bFGF 和 20 ng/ml BDNF 的神经扩增培养基）将每微升调整为 1.0 × 105 个活神经干细胞。</li>
	<li>细胞按步骤1.5所述保存于神经扩增培养基中，移植前置于冰上，且应在6小时内使用，以尽量减少因长时间冷藏导致的细胞死亡。</li>
</ol>
2. 放射治疗——治疗计划与照射
<ol>
	<li>将麻醉后的无胸腺裸鼠以俯卧位放入实验室磁共振成像（MRI）扫描仪中，头部朝上（头先进）。该3特斯拉扫描仪专为小型动物扫描设计，能够提供具有高空间分辨率的横断面（轴向）图像，并呈现优异的软组织对比度。扫描聚焦于颅骨区域，生成一组22张T2 E60加权图像，层厚为0.8 mm。这些图像提供了必要的信息，用于识别大鼠脑内的左右海马结构。</li>
	<li>MRI扫描后24小时，动物再次接受麻醉（麻醉混合物：氯胺酮30 mg/kg、赛拉嗪2.5 mg/kg和乙酰丙嗪1 mg/kg），并置于放射肿瘤学用CT扫描仪中，获取另一组横断面（轴向）图像数据。大鼠被放置在与MRI扫描时相同或相近的位置，CT设备设定为扫描颅骨区域，共生成106张层厚为0.8 mm的CT图像，作为放射治疗计划的数据基础。</li>
	<li>治疗计划
	<ol class="lalpha">
		<li>通过DICOM（医学数字成像与通信）标准，将MRI和CT图像数据传输至ECLIPSE（Varian Medical Systems, Palo Alto, CA）治疗计划软件。ECLIPSE是一种先进且商业化的放射肿瘤学软件，用于为患者建模并设计最优的放射治疗方案。该软件整合从CT图像中提取的器官密度信息，用于计算体内辐射剂量分布。</li>
		<li>用小型手术巾覆盖动物，仅暴露头部。将耳杆插入外耳道，将动物头部牢固固定于立体定位框架（Benchmark Digital, Leica-myNeurolab）中。将耳杆尖端滑入耳道时需格外小心。通过钩住大鼠上颌门齿并调节门齿杆高度至标准参考点，放置门齿杆，然后拧紧鼻夹。</li>
		<li>调整头部在双侧耳杆之间的位置，使其居中，侧向移动最小（±4 mm），以达到立体定位零点。</li>
		<li>下一步是确定所采用的照射技术。调强放射治疗（IMRT）和容积调强弧形治疗（VMAT），后者以RapidArc形式实现，是两种高精度照射技术，均使用6 MV光子束进行剂量递送3-6。两种技术的区别在于：IMRT通过多个静态射束路径照射，每条路径对应不同方向，但均汇聚于靶区，更适合极小靶区；而RapidArc则通过一个或多个围绕靶区的动态弧形照射递送剂量（图4）。</li>
		<li>无论采用何种递送方式，均需在ECLIPSE的剂量优化窗口中输入靶区剂量、靶区适形度以及关键器官的剂量限制参数。结合器官体积信息，系统通过在照射过程中持续调节射束衰减，实现个性化剂量分布。</li>
		<li>一旦生成治疗计划，ECLIPSE会将计算所得的剂量分布叠加显示在轴向、冠状和矢状图像上（图5），并以剂量-体积直方图（DVH）形式呈现（图6）。此时需评估该计划是否适合实施，或是否需要进一步优化。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>照射过程
	<ol>
		<li>治疗计划获批后，从ECLIPSE中的CT治疗计划数据生成数字重建放射影像（DRR）。这些正交图像以骨密度加权，突出显示颅骨及其他骨性解剖标志。随后，治疗计划和DRR通过DICOM传输至治疗递送计算机系统。</li>
		<li>递送系统控制一台Varian Trilogy直线加速器，该设备通常用于人类放射治疗。加速器配备120片由计算机控制的薄型多叶准直器（MLC），以及集成于机载成像（OBI）系统中的诊断级X射线成像系统。该递送系统接收ECLIPSE特定信息，并重新配置加速器中的准直器参数，以执行预定剂量递送。</li>
		<li>此时准备大鼠进行照射，将其麻醉后用纸毯覆盖以保持体温。数分钟后，将大鼠连同纸毯一起置于治疗床上，仅暴露颅骨，体位与CT扫描时一致。此步骤至关重要，因为体位准确性直接影响剂量递送的精确性。</li>
		<li>大鼠在治疗床上正确就位后，使用Trilogy的OBI系统采集一组正交X射线图像。这些高分辨率图像随后通过OBI图像融合软件与ECLIPSE生成的DRR进行融合。</li>
		<li>利用软件对X射线图像与DRR进行数字化匹配，获得治疗床需调整的位置偏移量，以实现图像的共配准（图7）。在审核该偏移信息并确认其不会导致加速器与治疗床发生意外碰撞后，计算机自动执行偏移指令，治疗床随之移动至目标位置。</li>
		<li>此时开始照射。采用6野IMRT计划递送10 Gy剂量时，射束开启时间约为10分钟；而双弧RapidArc则约需3分钟。治疗结束后，将大鼠移出治疗室，在加热垫上的饲养笼中恢复。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 人干细胞海马内移植的立体定位手术
<ol>
	<li>动物饲养与手术准备
	<ol class="lalpha">
		<li>本研究采用来自美国国家癌症研究所（National Cancer Institute）的两个月大ATN大鼠（品系0N01 Cr:NIH-rnu动物被饲养在无菌笼具中，并置于温度和光照可控的屏障环境中，保持12小时光照/12小时黑暗的循环周期。大鼠可自由摄取经高压灭菌的饲料和水，并每周使用Vetropolycin眼膏（Western Medical Supply，Arcadia，CA）清洁眼睛，以预防眼部感染。</li>
		<li>立体定向手术期间，大鼠通过腹腔注射麻醉混合液（氯胺酮 30 mg/kg、赛拉嗪 2.5 mg/kg 和乙酰丙嗪 1 mg/kg）进行麻醉。注射后 10–15 分钟可达到完全麻醉状态，通过触觉反射（脚趾夹捏）监测镇静程度。若手术过程中需要，可追加原剂量的 15–20% 以维持足够的麻醉深度。</li>
		<li>使用电动剪毛器去除头部毛发。手术区域应剃除约200%范围的毛发，以防止毛发引起感染。切口前，先用聚维酮碘/碘伏擦拭剃毛区域3次，再用70%酒精擦拭3次，清洁手术部位。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>立体定向手术
	<ol class="lalpha">
		<li>立体定位仪（数字显示器和框架）、微型电动钻、干热灭菌器及其控制器应置于超净工作台内，以防止ATN大鼠手术过程中可能发生感染。可使用配备内置加热垫的立体定位手术台以维持动物术中体温。整个手术过程中，我们使用“Kimberly-Clark Safeskin Purple Nitrile Sterile Exam Gloves”无菌检查手套（每只手套独立包装于无菌袋中，货号：55093）。此外，术者在手术过程中使用70%酒精喷雾对手部进行消毒。</li>
		<li>用小型手术巾覆盖动物，仅暴露头部。将耳杆插入外耳道，将动物头部牢固地固定在立体定位仪（Benchmark Digital, Leica-myNeurolab）中。将耳杆尖端滑入耳道时需格外小心。将上切牙钩挂在大鼠上切牙上，调整切牙杆高度至标准参考点，然后拧紧鼻夹。</li>
		<li>将头部位置在耳杆之间居中，侧向移动最小（± 4 mm），以达到立体定位零点。</li>
		<li>完成上述定位步骤后，涂抹润滑性眼膏以防止眼睛干燥，并避免可能的碘或酒精溅入造成损伤。手术过程中至少使用该眼膏2次。</li>
		<li>使用无菌手术刀沿头皮正中线做皮肤切口（2 cm），并用无菌棉签清洁。避免损伤尾侧和颈部肌肉区域。</li>
		<li>使用解剖牵开器撑开骨膜，并用蘸有1%过氧化氢（以PBS配制）的棉签清除软组织。为控制出血，使用棉签或纱布施加牢固压力至少1分钟。用力刮擦以清洁颅骨，轻拍方式处理皮肤，直至颅骨缝、前囟和人字缝清晰可见。</li>
		<li>以颅骨缝合点（bregma）为参考，利用大鼠脑图谱确定精确的立体定位坐标7每个半脑在四个不同的位点进行干细胞移植，所用立体定位坐标如下：
		<ol class="lroman">
			<li>前-后（AP）方向位于颅骨缝前3.0 mm，内-外（ML）方向距中线1.8 mm，背-腹（DV）方向距脑表面3.2 mm。</li>
			<li>AP，3.6 mm；ML，2.5 mm；DV，3.2 mm</li>
			<li>AP，4.2 mm；ML，3.2 mm；DV，3.2 mm</li>
			<li>AP，4.2 mm；ML，3.2 mm；DV，3.2 mm</li>
		</ol>
		</li>
		<li>确定前囟后，应在数字显示/控制器（数字立体定位仪）上将所有三个坐标（前后、内外侧和背腹）归零。随后，使用前述坐标，通过固定在支架上的细尖标记笔在颅骨上标记精确的移植位点。</li>
		<li>使用脚踏控制的微型电机钻（Leica-myNeurolab）和0.35 mm钻头（1/4号牙科磨头，碳化钒钻头）在颅骨上钻孔。注意避免损伤硬脑膜。若钻孔过程中发生出血，应用棉签施加稳固压力止血。切勿在钻孔部位使用酒精或碘剂，以免引起动物刺激。</li>
		<li>大鼠接受双侧海马内注射神经干细胞悬液，注射体积最大为 1 μL 使用一个 5 μL Hamilton 微量注射器（30 号针头）。该体积内的细胞确切数量将根据实验具体情况而有所不同。为此，将微量注射器固定于立体定位仪上的小型探针夹持器中。小心将针头尖端插入颅骨，直至到达脑表面即 脑膜）。此时，应在数字显示屏/控制器上将DV坐标归零，然后轻轻将针插入至目标深度（DV，3.2 mm）。在注射细胞前等待1分钟。</li>
		<li>注射 0.25 μL 体积/分钟（缓慢释放），使用定时器。当累计达到 1 μL 注射后，等待8分钟，再从移植部位撤出针头。此后，缓慢撤出针头（0.5 mm/min），以防止注射内容物通过针道发生毛细管回流。</li>
		<li>按照步骤 3.2(j-k) 对剩余的移植位点（每半球 4 个）进行操作。</li>
		<li>移除颅骨上的皮肤牵开器，使用钝头镊子轻轻牵拉回缩的皮肤，并用 Autoclips 外科缝合器（Leica-myNeurolab）施加 4–5 个无菌不锈钢夹。</li>
		<li>将动物从固定架上取下后，注射镇痛剂（布托啡诺，0.1 mg/kg，皮下，每12小时一次）和乳酸林格氏液（5 mL/250 g成年大鼠，皮下）。</li>
		<li>将动物放回笼中，笼子应置于加热垫上。在动物恢复意识前持续监测，之后再将其送回饲养室。在每个动物笼内另放一个培养皿，其中放置湿润的颗粒饲料（动物饲料）和Transgel。或者，也可使用DietGel Recovery（ClearH2O，缅因州波特兰）可作为水分和养分的来源。</li>
		<li>在动物恢复期间进行监测，并给予镇痛处理（布托啡诺 0.02 mg/kg，每12小时一次，持续2天）。观察是否存在疼痛、痛苦、手术部位发红或感染的迹象。每日涂抹聚维酮碘或新孢霉素软膏一次（持续2–3天），以预防可能的感染。若在术后12小时内，经镇痛或抗生素治疗后仍持续出现感染、疼痛或痛苦的迹象，应咨询兽医或动物护理人员以获取进一步协助。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 代表性结果：
<img alt="裸鼠辐照示意图；神经干细胞增殖、BrdU标记、移植。" src="/files/ftp_upload/3107/3107fig1.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
图1. 实验方案的示意图。
<img alt="CT 和 MRI 脑部扫描；轴向、冠状、矢状视图；诊断成像比较。" src="/files/ftp_upload/3107/3107fig2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2. 在 ECLIPSE 软件中融合 CT（骨性解剖结构）与 MRI（软组织）图像。通过匹配轴向、冠状和矢状切面，可实现从不同成像方式获取的大鼠脑部关键解剖特征的共配准。
<img alt="显示海马体及距离的脑部横截面 MRI；带有标注的解剖图。" src="/files/ftp_upload/3107/3107fig3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 3"> 
图 3. 脑内勾画出的海马体区域。在图像融合后，海马体以及除海马体外的脑组织被识别，并沿轴向勾画，以定义这些器官的特定体积区域。这些区域提供了调整剂量分布至目标区域所需的解剖结构和体积信息。
<img alt="放射治疗计划示意图，6野调强放疗与2弧容积调强弧形放疗的剂量分布分析。" src="/files/ftp_upload/3107/3107fig4.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图4"> 
图4. 使用调强放射治疗（IMRT）或以 RapidArc 形式实现的容积调强弧形治疗（VMAT）进行高精度照射的方案。这些技术可递送 6 MV 的光子束，前者以多个静态射束路径照射并汇聚于极小靶区体积（IMRT），后者则以一个或多个动态弧形射束聚焦于靶区（RapidArc）。
<img alt="放射治疗计划，海马体照射；IMRT与RapidArc，剂量分布，CT扫描示意图。" src="/files/ftp_upload/3107/3107fig5.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图5"> 
图5. ECLIPSE计算的剂量叠加于轴向图像上。所示剂量为单侧或双侧海马体照射治疗计划的剂量分布。
<img alt="左、右海马体的剂量-体积直方图；辐射剂量（Gy）与体积（%）的关系。" src="/files/ftp_upload/3107/3107fig6.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 6"> 
图6. ECLIPSE 计算的剂量-体积直方图。数据对比了在图5所示的单侧海马体治疗计划下，受照与非受照海马体体积的百分比。
<img alt="使用OBI X射线系统进行放射治疗设置、CT图像、冠状位和侧位X射线对比。" src="/files/ftp_upload/3107/3107fig7.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图7"> 
图7. 放射治疗中基于图像引导的大鼠体位定位。在ECLIPSE系统中，由CT治疗计划数据生成的正交数字重建放射影像（DRR）与大鼠在治疗床上通过Trilogy机载成像（OBI）系统采集的正交X射线图像进行融合。DRR图像以骨密度加权，突出显示颅骨及其他骨性解剖标志，有助于与OBI图像进行配准。通过比对这两组图像，可获得治疗床所需的位置调整参数，以实现CT图像与X射线图像的精确配准。
<img alt="海马区示意图；标注区域 CA1、CA3、DG；组织学脑图谱。" src="/files/ftp_upload/3107/3107fig8.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 8"> 
图 8. 立体定向手术后移植神经干细胞（NSCs）的位置。移植后1个月，对动物进行灌注，取脑组织切片，并用BrdU染色（以检测移植的NSCs），复染苏木精。针道（Nt，红线）显示了注射轨迹，将NSCs注入移植释放位点（Tr），位于胼胝体（CC）下方、CA1上方。移植的NSCs从Tr位点广泛迁移至宿主海马体各区域（齿状回，DG；齿状回门部，DH；CA1和CA3亚区；放大倍数×4）。比例尺，200 μm。

<ol><li>Acharya, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consequences+of+ionizing+radiation-induced+damage+in+human+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Free.+Radic.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Consequences of ionizing radiation-induced damage in human neural stem cells.</a> Free. Radic. Biol. Med. , (2010).</li>
<li>Acharya, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+radiation-induced+cognitive+impairment+through+cranial+transplantation+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Rescue of radiation-induced cognitive impairment through cranial transplantation of human embryonic stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 19150-19155 (2009).</li>
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</ol>

无利益冲突声明。

目前有大量研究正在探索利用干细胞在临床上恢复受损、衰老及病变组织正常功能的多种途径8。要最终实现这些目标，需要深入理解移植细胞在与正常未受损组织截然不同的独特微环境中的行为特征。我们的研究已证明，在经辐照的组织床中，颅内移植的神经干细胞（NSCs）能够功能性地恢复认知能力，这些细胞可在体内存活、迁移，并沿神经元和胶质细胞谱系分化2。目前尚不完全清楚这些细胞介导认知恢复的具体机制，但其实现依赖于以可重复的方式进行一系列严格控制的实验操作。本文详细描述了这些关键实验步骤，旨在加速干细胞疗法在改善脑部及其他类型癌症临床治疗过程中所导致不良认知效应方面的转化潜力。以下还强调了可能对数据质量产生重要影响的其他注意事项。
基于移植的疗法依赖干细胞作为关键试剂，因此必须仔细表征细胞培养物、维持无菌状态，并使用匹配的传代次数以确保结果的可靠性。在手术前，移植的人源干细胞用 BrdU 进行标记，以便在体内追踪这些细胞。in vivo。在我们的实验条件下，移植的神经干细胞（NSCs）未发生广泛增殖，因此 BrdU 标记的稀释并不构成问题。此外，也可通过免疫染色检测人源特异性标志物（如核基质蛋白（h-NUC 或 hNUMA）9 或人源特异性核抗原（HuNu）2）来区分移植的人源干细胞与宿主细胞。人源干细胞还可被多种荧光标记物标记，以方便其在宿主脑组织中的识别。
关注照射参数可定义精确的剂量递送技术，本文所述方法模拟了放射肿瘤学中的现行临床实践。干细胞在脑内的可重复移植同样至关重要，这可通过数字立体定位仪器实现。该装置能够精确操控微量注射器，将干细胞植入海马体等微小脑结构中，从而显著减少人为误差。利用该装置，神经干细胞（NSCs）被移植至大鼠海马体从前到后四个不同的位点。背腹（DV）坐标基于无胸腺裸鼠（ATN）的操作经验确定，以确保手术过程不会损伤海马结构2。大鼠脑的冠状切面展示了海马结构的关键组成部分，包括齿状回（DG）、齿状回门部（DH）以及CA1和CA3亚区（图8）。从可见针道（Nt，红线）背侧注入的移植神经干细胞表现为深染（棕色）细胞，沉积于胼胝体（CC）下方的移植释放位点（Tr），随后沿整个海马的隔颞轴迁移。

<table><tbody><tr><td>带45&amp;deg;和18&amp;deg;耳杆的数字立体定位仪</td><td>颅内移植手术装置</td><td>徕卡显微系统公司</td><td>39463501</td><td>有用附件：带加热器的载物台和可变电流源（用于手术期间维持体温）</td></tr></tbody></table>

用于恢复颅脑放疗所致认知功能障碍的干细胞移植策略

Stem Cell Transplantation Strategies for the Restoration of Cognitive Dysfunction Caused by Cranial Radiotherapy

对于患有原发性或转移性脑肿瘤的患者，放射治疗往往是唯一的临床治疗手段。尽管放疗具有一定的疗效，但颅脑照射可能引发进行性且严重的认知功能下降，部分原因可能是神经干细胞的耗竭所致。随着脑癌患者生存期的延长，认知健康相关的生活质量日益受到关注，尤其是在目前尚无令人满意的长期治疗方法的情况下。
为应对这一严重的健康问题，我们采用干细胞替代策略来对抗辐射引起的认知功能下降。本模型使用经颅脑照射的无胸腺裸鼠。电离辐射可通过全脑照射或高度聚焦的束流定向照射海马体的方式递送。 lin耳 a基于直线加速器（LINAC）的立体定向放射外科治疗。照射后两天，将人神经干细胞（hNSCs）通过立体定向移植至海马体。随后在照射后1个月和4个月评估大鼠认知功能的变化、移植物细胞的存活情况以及分化特异性标志物的表达。我们的认知测试范式显示，移植了hNSCs的动物在认知功能方面表现出显著改善。无偏倚体视学分析显示，移植物细胞在移植后1个月和4个月时具有显著的存活率（10–40%），具体比例取决于移植细胞的数量和类型。移植物细胞广泛迁移，沿胶质细胞和神经元谱系分化，并表达多种未成熟和成熟表型标志物。
我们的数据表明，移植的人类干细胞可直接带来认知功能的益处，提示该操作未来可能为接受颅脑放射治疗个体的认知功能长期恢复提供一种有前景的策略。为了促进复制和拓展本研究所需关键操作步骤的传播，我们以书面和可视化形式记录了实验方案中的多个关键步骤，重点聚焦于立体定向放射外科和细胞移植过程。

脑肿瘤患者通常需要接受颅脑放射治疗，这种治疗虽然有益，但常常导致严重的认知功能障碍。这一尚未解决的严重问题目前在临床上尚无应对措施，因此推动了我们致力于开发基于干细胞的疗法，以恢复放射治疗引起认知功能下降。

放射治疗通常是原发性或转移性脑瘤患者唯一的临床治疗手段。尽管有益，颅脑照射……

以下实验的总体目标是将干细胞可重复地移植到海马体中。首先，对无胸腺大鼠实施立体定向放射治疗，以模拟脑癌临床治疗过程中可能发生的情况。在实验室中培养用于移植的人类神经干细胞，通常每只大鼠的治疗需要100万个细胞。照射后两天，将干细胞缓慢注射到海马体的精确位置。最终，该方案展示了移植的干细胞在海马体内的迁移过程。当我开始思考利用干细胞逆转颅脑照射后神经发生抑制的可能性时，首次提出了这些方法。通常，熟悉该方法的人会面临困难，因为干细胞的培养并非易事，且需要在无抗生素的培养条件下进行每日的照料与维护。本操作的可视化演示将揭示用于精确照射小而边界清晰的脑部区域的影像重建临床流程。本次照射操作的演示由本部门临床教授Dante Rowa博士进行。干细胞的制备将由本实验室的技术员Mary Land和Catherine Tran女士演示，而移植所需的操作流程则由博士后学者Muja博士进行演示。我们在治疗前利用图像引导放射治疗软件对动物进行精确定位，并采用调强放射治疗技术，以实现对靶区的精准照射，同时尽量减少对脑部其他区域的辐射损伤。在磁共振成像（MRI）扫描24小时后，将已麻醉的动物置于放射肿瘤学用CT扫描仪中，获取另一组横断面图像数据。将大鼠置于与MRI扫描时相同的位置，并设置CT设备扫描颅骨区域，以生成用于放射治疗计划的CT数据。获取106张层厚为0.8毫米的CT图像。随后，将MRI和CT图像数据传输至Eclipse治疗计划软件。使用Eclipse根据骨性解剖结构和软组织匹配对MRI与CT数据进行融合。此步骤的时间可变，根据图像质量的不同，该过程可能需要一到三个小时。获得满意的图像融合后，勾画出需要照射的目标区域以及邻近的关键器官。照射可覆盖全脑，也可限制在特定的容积区域，如单侧海马。轮廓不仅提供了这些器官的位置信息，还提供了对调整剂量分布至关重要的体积信息。在 Eclipse 的剂量优化窗口中输入靶区剂量、靶区适形度以及危及器官的剂量限制等参数。计划生成后，eclipse 会将计算出的剂量叠加显示在轴向、冠状和矢状图像上，同时以剂量-体积直方图的形式呈现。此时需要对计划进行评估，以确定其是否适合实施照射，或是否需要进一步优化。开始照射过程时，将一只已麻醉的大鼠置于纸制毯子下以保持体温。数分钟后，将大鼠放置于放射治疗直线加速器的治疗台上，治疗台需覆盖毯子，但暴露颅骨。务必将其置于此前进行CT扫描时所使用的位置。此步骤至关重要，以确保剂量递送的准确性。接下来，使用放射治疗直线加速器上的成像系统获取麻醉大鼠的正交X射线图像，将这些正交X射线图像与Eclipse提供的参考图像集进行配准，并进行必要的位置校正以实现准确的图像对齐。照射方案采用10分级剂量，单侧海马照射使用六野调强放疗（IMRT）计划，双侧海马照射则采用两弧容积旋转调强放疗（RapidArc）计划。治疗结束后，将大鼠从治疗室中取出，移除包裹材料，并将其置于加热的饲养笼中恢复。手术准备时，使用电动剪毛器去除麻醉后的A TN大鼠头部的毛发。在超净工作台内，用聚维酮碘和70%乙醇反复擦拭剃毛区域进行清洁。准备好立体定位仪、微量钻、干热灭菌器及控制器。手术过程中将动物置于加热表面以保持其体温。手术前及整个手术过程中均佩戴无菌手套，并用70%乙醇喷洒。手术器械保存在专用的层流罩内。为维持无菌条件，用小型手术巾覆盖动物，仅暴露头部。将耳杆插入外耳道，使动物头部牢固地固定在立体定位仪框架内。将耳杆尖端滑入耳道时需格外小心。通过钩住大鼠的上门齿并调节杆的高度至标准参考点来放置门齿杆。然后拧紧鼻夹。将头部位置在耳杆之间居中，尽量减少侧向移动，以达到立体定位零点。将动物放置到位后，涂抹润滑眼膏以防止角膜干燥。手术过程中需再次涂抹一次眼膏。使用无菌手术刀，沿头皮正中线做一道两厘米长的皮肤切口。使用无菌棉签清洁该区域。接着，插入解剖牵开器以保持骨膜开放。如果出现出血，应对该区域施加牢固的压力。使用浸有1%过氧化氢的棉签，清除覆盖颅骨的软组织，直至颅骨的前囟（bgma）和人字缝（lambda）可见。立体定位手术中最困难的环节是将动物头部在立体定位仪框架中进行精确定位。为了在动物颅骨上标记精确的立体定位坐标，本研究中使用脑图谱，以前囟（bgma）作为参考点来确定精确的立体定位坐标。干细胞移植在四个不同位点进行，具体立体定位坐标如下，用于在颅骨上标记相应位置：首先，确定前囟（bgma）。接下来将数字显示控制器上的三个坐标归零。归零后，使用预设的坐标定位移植位点，并利用安装在支架上的细尖标记笔在相应位置做标记。使用钻头在每个标记位置的颅骨上钻出 0.35 毫米的孔。注意防止损伤杜氏膜。若钻孔过程中发生出血，应使用棉签施加牢固压力止血。动物现已准备就绪，可进行移植。用于移植的人类神经干细胞应提前准备好，并在使用前置于冰上保存。准备就绪后，用五微升30号Hamilton微量注射器吸取细胞悬液。将装满液体的注射器连接到立体定位仪上的小型探针固定器上。移动至正确位置后，小心地将针头插入颅骨上的孔洞，直至到达脑表面。在数字显示控制器上将背腹（DV）坐标归零，然后轻柔地将针头插入至目标深度。将针头保持在原位一分钟。此后，以每分钟0.25 µL的速度注射细胞，总量为1 µL。注射完成后，将针头在原位保留八分钟，以防止注射内容物通过针道发生毛细管回流；随后以每分钟0.5 mm的速度缓慢将针头从移植部位撤出。对剩余的移植位点重复此操作。注射完成后，移除皮肤拉钩，并用钝头镊子轻轻将皮肤拉回覆盖颅骨。术后使用四到五个无菌不锈钢夹闭合伤口。将动物放入加热的笼子中，并监测其恢复情况。移植后一个月，对脑组织样本进行切片，使用BRDU染色以检测移植的神经干细胞（NSCs），并用伊红复染。图中红色线条所示的针道表示将神经干细胞注入指定移植释放位点（TR）的注射轨迹。在此，移植的神经干细胞从胼胝体和海马CA1区域广泛迁移至齿状回及海马CA3区域。重要的是，所获取的磁共振成像（MRI）数据集必须准确对应相应的CT图像数据集。在治疗操作前，精确的图像融合对于识别海马区域并进行后续勾画至关重要。获取正交X射线图像以确认动物体位准确无误。为确保移植成功，手术过程中须始终保持无菌环境。标记Otax坐标，精确定位，并在注射后缓慢撤出微量注射器，以防止液体反流。观看本视频后，您应能够充分理解如何使用您选择的动物模型进行具有临床相关性的放射处理，以及如何将干细胞外科移植至大脑的特定区域。

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医学

颅放疗引起的认知功能障碍恢复干细胞移植策略

神经前体细胞移植是一种有前景的策略，可用于保护和/或替代脊髓损伤（SCI）及运动神经元病——肌萎缩侧索硬化症（ALS）中丧失或功能异常的颈段膈运动神经元。本文提供了在ALS和SCI啮齿类动物模型中，将细胞递送至颈段脊髓前角的实验方案。...

脊髓内细胞移植用于靶向治疗肌萎缩侧索硬化症和创伤性脊髓损伤中的颈段腹角

由脑肿瘤放射治疗引起的认知功能障碍是一种临床上难以解决的病症，会严重影响患者的生活质量。要有效评估可能缓解辐射所致认知减退的干预措施，最终依赖于能否对认知功能进行严格的定量评估。...

量化颅脑放射治疗引起认知功能下降

来源：Furmanski, O., et al. 小鼠脑损伤的可控皮层冲击模型结合人诱导多能干细胞来源的神经细胞治疗性移植. J. Vis. Exp.

立体定向移植神经细胞悬液至创伤性脑损伤小鼠

由于干细胞具有内在的肿瘤趋向性，它们作为治疗脑肿瘤的载体具有广阔前景。非侵入性的经鼻干细胞递送可绕过血脑屏障，在临床转化方面展现出巨大潜力。本文总结了在胶质瘤小鼠模型中经鼻干细胞递送的基本原理。...

小鼠模型中通过鼻内递送治疗性干细胞至胶质母细胞瘤

具有肿瘤趋向性的治疗用间充质干细胞（MSCs）在治疗侵袭性胶质母细胞瘤方面展现出良好前景。最佳移植策略涉及将MSCs接种于支架材料后递送至肿瘤切除腔内。本文提供了用于研究MSC治疗胶质母细胞瘤的临床前技术，包括：影像引导下的肿瘤切除；接种MSC的支架植入；以及术后治疗监测。...

图像引导下胶质母细胞瘤切除及治疗性干细胞接种支架的颅内植入

本文介绍了一种在携带原位人源性原发性脑肿瘤的免疫缺陷小鼠中，制备并进行立体定向移植同种异体人淋巴细胞的实验方案。本研究为细胞免疫疗法经颅内递送的可行性和抗肿瘤疗效提供了概念验证。...

立体定向过继性移植细胞毒性免疫细胞至原位人源多形性胶质母细胞瘤异种移植小鼠模型

本方案展示了开颅小鼠创伤性脑损伤模型的建立方法，以及将体外培养的人诱导多能干细胞来源的细胞移植至损伤部位的技术。同时简要描述了对这些操作结果进行的行为学和组织学检测。...

小鼠脑损伤的可控皮层冲击模型结合人诱导多能干细胞来源神经细胞的治疗性移植

我们描述了将经携带双报告基因载体（表达荧光素酶-绿色荧光蛋白（GFP））转导的人类神经前体细胞移植至小鼠脑实质内的方法。移植后，利用活体成像系统反复检测荧光素酶信号。 体内 利用荧光显微镜在脑组织切片中鉴定表达生物发光和GFP的移植细胞。...

颅内移植与 体内 小鼠大脑中人神经前体细胞的生物发光示踪

中枢神经系统（CNS）肿瘤是儿童癌症相关死亡的首要原因，目前针对患者的局部区域免疫疗法正在越来越多地进入临床试验。本方案描述了在小鼠中进行局部区域导管植入的方法，用于临床前评估靶向中枢神经系统肿瘤的免疫治疗药物输注效果。...

小鼠颅内套管植入术用于局部序贯输注嵌合抗原受体（CAR）T细胞

本研究提出了一种新型经颅直流电刺激（tDCS）方案，并结合认知刺激以治疗卒中后偏侧空间忽略。来自一名初步患者的初始数据证实了该操作的可行性，并提示其潜在疗效，为未来开展平行、三盲、对照的临床试验奠定了基础。...

随机、三盲、平行对照经颅直流电刺激治疗卒中后认知康复的临床试验

了解颅放疗后干细胞移植恢复认知功能的方法，通过向无胸腺大鼠海马区移植人神经干细胞，建立可重复的精准注射与立体定向放疗方案，为脑肿瘤患者认知障碍治疗提供研究框架。

用于恢复颅脑放疗所致认知功能障碍的干细胞移植策略

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