0 次观看 • 4:08 分钟 • July 8th, 2025
从培养在黏附性基底膜基质上的人源诱导性多能干细胞克隆开始。
加入含有特定激素、生长因子和小分子抑制剂的小脑分化培养基。
使用玻璃移液管挑取菌落，并将其转移至超低吸附培养板中。
低吸附表面使细胞保持悬浮状态，促进其聚集成三维的胚胎样小体（embryoid bodies，EBs）.
激素、生长因子和抑制剂与其相应的靶位点结合，促进干细胞向神经前体细胞分化。
将拟胚体转移至包被有合成聚合物和黏附蛋白的培养板孔中，以促进拟胚体的贴附。
用不含抑制剂的分化培养基替换原培养基。
细胞开始从拟胚体向外迁移，形成二维单层细胞层。
移除培养基，并加入小脑成熟培养基。
培养基中的生长因子诱导神经元前体细胞成熟为不同类型的 cerebellar 神经元前体细胞。
在第0天，向六孔超低吸附（ULA）板的每孔中加入1毫升添加了10微摩尔Y27632和SB431542的小脑分化培养基，并将该板放入培养箱中，直至准备将悬浮的细胞集落加入各孔。使用拉制的玻璃移液管对已分化的细胞进行清洗。吸除培养基，然后为每个35毫米培养皿加入1毫升iPSC传代溶液。
在37摄氏度孵育3分钟后，吸除培养基，并加入2毫升添加了10微摩尔Y27632和SB431542的 cerebellar 分化培养基。在透射光倒置显微镜4倍放大倍数下，使用拉制玻璃移液管的弯曲边缘挑起细胞集落。待所有集落均被挑起后，用10毫升血清移液管将全部集落轻柔转移至6孔ULA板中的一个孔内。对每块iPSC培养板重复此过程，并将细胞置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养。
第2天，向每孔中加入FGF2，使其终浓度为50纳克/毫升。第7天，通过吸取1毫升用过的培养基并加入1毫升新鲜的小脑分化培养基，更换三分之一的培养基。将拟胚体培养7天。
第14天，轻轻晃动培养板，使所有类胚体聚集于培养板中央。然后倾斜培养板，使用1000微升移液器从边缘吸除全部用过的培养基。随着培养基体积减少，缓慢将培养板放平并继续吸除，保留足够量的培养基以避免类胚体干燥。
接着，加入3毫升新鲜的小脑分化培养基，并添加10微摩尔的Y27632。然后，使用10毫升血清移液管将类胚体转移至经多聚-L-鸟氨酸和层粘连蛋白包被的培养皿中。第15天时，吸除培养基，并更换为新鲜的小脑分化培养基。