从小鼠胚胎脑组织中培养和维持多巴胺能神经元

胰蛋白酶-EDTA溶液处理富含发育中的多巴胺能神经元的胚胎中脑组织，使其与组织基质分离。

加入失活培养基抑制酶活性，然后洗涤去除

反复移液组织。胚胎神经元具有较少的投射，减少了这种干扰期间的应力并产生单细胞悬浮液。

心并除去上清液，然后将神经元重悬于完全培养基中。将这些神经元转移到聚合物涂层的盖玻片上以进行细胞附着。

将盖玻片放入具有完整培养基的多孔板中，提供神经元生长所必需的营养物质和生长因子。

培养基中的抗生素可防止细菌生长，支持神经元活力。

随着神经元的生长和成熟，它们会发育出细胞投射，例如轴突和树突，形成突触连接。

定期去除一半的用过的培养基，以消除有毒副产品。

添加新鲜培养基以长期维持多巴胺能神经元。

引擎盖下，从腹侧中脑的集合中取出 HBSS。然后，加入一毫升温热的0.05%胰蛋白酶-EDTA，足够12片组织的溶液。将组织在37摄氏度下孵育5至10分钟。在引擎盖下，用 1 毫升失活培养基替换胰蛋白酶-EDTA。

轻轻旋转混合物，然后除去失活培养基，但留下足够的培养基，以免丢弃解离的细胞。接下来，用完全培养基洗涤组织两次，而不会丢失细胞。现在，加入 1 毫升完全培养基。然后，用火抛光移液器研磨组织，不要形成气泡，直到获得单细胞悬浮液。大约 8 到 10 次就足够了。

研磨后，将400克的细胞离心5分钟。取出培养基，并将细胞重悬于 1 毫升完全培养基中。移液细胞最多 4 次以获得悬浮液。首先使用台盼蓝排除和血细胞计数器对悬浮液中细胞的健康状况进行计数和评估。

现在，将细胞悬液调整为每微升 1,500 个细胞。然后，将灭菌的微量离心管盖转移到 100 毫米培养皿中。使用镊子将准备好的盖玻片放在盖子上。不要清洗盖玻片，尽量不要让它们变干。将 100 微升悬浮液装载到每个盖玻片上。

这种有点不寻常的方法提供了 90% 的培养活力，是成功的关键一步。然后，关闭培养皿，并将其转移到培养箱中一个小时。孵育后，小心地将带有培养基的盖玻片转移到24孔板中，每个孔中含有400微升加热至37摄氏度的完全培养基。然后，将细胞孵育过夜。

最初的几个小时对细胞存活最为关键。在 24 小时内，轻轻地向每个孔中加入半毫升完全培养基。每 2 周更换一半的介质。如果培养物变黄，则可以更快地进行半培养基更换，但更换仍然应该不频繁。在这些条件下，多巴胺能神经元将存活 6 周以上。