0 次观看 • 4:22 分钟 • July 8th, 2025
使用胰蛋白酶-EDTA 溶液处理富含发育中多巴胺能神经元的胚胎中脑组织，以使其从组织基质中解离。
加入灭活培养基以抑制酶活性，然后洗涤以去除残留的酶。
反复吹打组织。胚胎神经元的突起较少，可在扰动过程中降低剪切应力，从而获得单细胞悬液。
离心并弃去上清液，然后将神经元重悬于完全培养基中。将这些神经元转移至经聚合物包被的盖玻片上，以促进细胞贴附。
将盖玻片放入含完全培养基的多孔板中，完全培养基可提供神经元生长所必需的营养物质和生长因子。
培养基中的抗生素可抑制细菌生长，从而支持神经元的存活。
随着神经元的生长和成熟，它们会发育出细胞突起，例如轴突和树突，从而形成突触连接。
定期移除一半的旧培养基，以清除有毒代谢副产物。
为多巴胺能神经元的长期维持添加新鲜培养基。
在通风橱内，从腹侧中脑组织中移除 HBSS。然后加入 1 毫升预热的 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 溶液，该体积适用于 12 份组织样本。将组织在 37 摄氏度条件下孵育 5 至 10 分钟。在通风橱内，用 1 毫升终止培养基替换胰蛋白酶-EDTA 溶液。
轻轻混匀混合物，然后移除失活培养基，但需保留足够培养基，以免弃去解离的细胞。接着，用完全培养基洗涤组织两次，注意不要丢失细胞。现在，加入 1 毫升完全培养基。然后，用火焰抛光的移液管反复吹打组织，避免产生气泡，直至获得单细胞悬液。通常吹打 8 至 10 次即可。
吹打重悬细胞后，在400 g 条件下离心5分钟。弃去上清液，并将细胞重悬于1毫升完全培养基中。用移液器轻轻吹打细胞至多4次，以获得单细胞悬液。随后使用台盼蓝染色法结合血细胞计数板对悬液中的细胞进行计数并评估细胞活力。
现在，将细胞悬液调整至每微升含1,500个细胞。然后，将已灭菌的微量离心管盖转移至100毫米培养皿中。用镊子将制备好的盖玻片放置在管盖上。不要清洗盖玻片，且尽量避免其干燥。向每张盖玻片上加入100微升细胞悬液。
这种略显特殊的方法可提供90%的培养物存活率，是成功的关键步骤。然后，盖上培养皿，将其转移至培养箱中孵育一小时。孵育结束后，小心地将带有培养基的盖玻片转移至24孔板中，每孔含有400 µL预热至37 °C的完全培养基。随后，将细胞孵育过夜。
最初的几个小时对细胞存活最为关键。24小时内，向每个孔中轻柔加入0.5毫升完全培养基。每两周更换一半培养基。如果培养基变黄，则可提前进行半量换液，但换液仍应尽量避免过于频繁。在这些条件下，多巴胺能神经元可存活6周以上。