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神经科学
0 次观看 • 4:48 分钟 • July 8th, 2025
从包含弥漫性内生型桥脑胶质瘤的脑干组织碎片开始，该肿瘤起源于富含髓鞘神经的环境中胶质前体细胞。
使用蛋白酶处理以降解组织的细胞外基质。
孵育后，反复吹打内容物以促进细胞解离和髓鞘降解。
过滤并离心以收集细胞。去除上清液，并将细胞重悬于预冷的缓冲液中。
加入蔗糖溶液用于密度梯度分离，并充分混匀。
接下来，离心以分离较重的细胞和较轻的髓鞘碎片。
去除髓鞘层，并加入红细胞裂解缓冲液。
加入冷缓冲液以终止裂解反应。离心后弃去上清液，以去除裂解的红细胞。
用预热的神经基础培养基重悬细胞，并在未包被的培养瓶中进行培养。
神经营养因子的缺失会导致神经元死亡，而胶质前体细胞则利用营养物质和生长因子，引发增殖。添加新鲜培养基以维持生长因子水平。
随着时间的推移，这些细胞会自发聚集形成细胞团簇，产生悬浮生长的神经球。
在此步骤中，将含有剩余组织碎片的锥形管离心五分钟。随后，弃去上清液，并加入预热的酶消化液，使每1毫升组织加入5毫升消化液。然后，用实验室封口膜密封锥形管管盖，并在37摄氏度下于旋转仪中孵育反应30分钟。
孵育后，轻轻吹打样品。使用10毫升血清移液管，将样品上下吹打6至8次，避免产生过多气泡。接着，在移液管末端安装1000微升枪头，再将样品额外吹打6至8次。
让其余的组织块沉降到管底。然后，将仍悬浮有细胞的上清液转移至一个已标记为“酶解离”的新50毫升锥形管中，过100微米滤膜过滤，并置于冰上保存。随后，将酶解离管以5分钟离心，继续进行蔗糖梯度离心。如果样品仍悬浮在溶液中，则再次离心5分钟。
接下来，弃去上清液，将组织重悬于 20 毫升不含钙和镁的冷 HBSS 中。然后用冷 HBSS 定容至 25 毫升。缓慢加入 25 毫升 1.8 摩尔蔗糖溶液，并倒置离心管以混匀。此操作可形成 0.9 摩尔蔗糖梯度。
随后，以无刹车模式离心样品10分钟。小心吸除髓鞘碎片及尽可能多的蔗糖溶液。然后，加入30毫升不含钙和镁的冷HBSS洗涤样品，并轻轻混匀。之后，离心5分钟。
在此步骤中，弃去洗涤上清液。加入 5 毫升 ACK 裂解缓冲液，轻轻重悬细胞沉淀，在室温下轻轻涡旋试管 1 分钟。然后加入 30 毫升不含钙和镁的冷 HBSS 以终止裂解反应。
随后，离心五分钟。用10至15毫升含生长因子的预温完全TSM重悬最终的细胞沉淀，并使用台盼蓝排斥法在血细胞计数板上定量活细胞密度。之后，将最终的细胞悬液转移至新的T75培养瓶中。每隔一天添加额外的生长因子以维持总体生长因子水平，并监测肿瘤细胞神经球的形成情况。