分离和培养小鼠小脑颗粒神经元祖细胞

以小鼠幼崽大脑为例。

均质化成更小的碎片。

添加蛋白水解酶来消化组织的细胞外基质，松弛小脑颗粒祖细胞（CGNP）和星形胶质细胞。

加入含有血清的CGNP培养基以停止酶活性。离心并丢弃富含酶的上清液。

组织片段重悬于 CGNP 培养基中。机械解离组织以释放细胞。

一旦碎片沉淀，将含有细胞的上清液转移到新鲜管中。

心并去除带有碎屑的上清液。

将细胞重悬于 CGNP 培养基中，并将它们接种到涂有聚-D-赖氨酸的多孔板孔中。孵化。

CGNP 相比，星形胶质细胞沉降并牢固地粘附在聚-D-赖氨酸涂层上。

摇动板并收集含有 CGNP 的上清液。离心并除去上清液。

将 CGNP 重悬于 CGNP 培养基中，并将它们接种到聚-L-鸟氨酸包被的多孔板上。孵化。

CGNP 附着在涂层表面并在培养基成分和聚-L-鸟氨酸的帮助下增殖。

将三到五个小脑转移到 15 毫升的管中。离心前用HBSS葡萄糖洗涤小脑。离心试管以收集组织。最后一次洗涤后，用1毫升移液器轻轻上下移液2至3次，使小脑均质化，直到碎片大小为0.5至1立方毫米。

轻轻取出所有液体，直到剩余 2.5 毫升。然后，将0.05%胰蛋白酶加入含有大脑的HBSS葡萄糖的管中，并将组织在37摄氏度的水浴中孵育15分钟。每 1 至 3 分钟倒置一次组织。孵育后，通过加入5毫升cGMP细胞培养基或CGM停止消化，并像以前一样通过离心收集组织。

离心后，除去上清液并加入 1 毫升 CGM。用 1 毫升移液器吸头研磨组织，避免形成气泡。然后，加入 5 毫升 CGM，并将混合物在冰上孵育两分钟以沉淀组织残留物。组织沉降后，将上清液转移到新的 15 毫升管中。然后，向残留组织中加入2毫升CGM，并在收获上清液并丢弃组织残余物之前重复研磨程序。

每管15毫升组织中汇集上清液，并离心以收集小脑细胞。将沉淀重悬于 10 毫升 CGM 中。由于星形胶质细胞比cGMP对聚-D-赖氨酸的粘附更快，更强，因此将最多4毫升的细胞悬液添加到聚-D-赖氨酸包被的6孔板的孔中，并在37摄氏度下孵育20分钟以去除星形胶质细胞。

摇动盘子。将上清液收集在15毫升管中，然后像以前一样离心上清液。将沉淀重悬于 10 毫升 CGM 中，并用 Neubauer 计数室计数细胞。4-6小时后，粘附的cGMP呈圆形，呈增殖性。将细胞接种在聚-L-鸟氨酸包被板上的CGM中，并在37摄氏度，5%CO₂和100%相对湿度下孵育。