0 次观看 • 4:34 分钟 • July 8th, 2025
取小鼠幼崽的小脑。
将它们匀浆成较小的片段。
加入蛋白酶以消化组织的细胞外基质，使小脑颗粒前体细胞（CGNPs）和星形胶质细胞松散。
加入含血清的 CGNP 培养基以终止酶活性。离心后弃去富含酶的上清液。
将组织碎片重悬于 CGNP 培养基中。通过机械法解离组织以释放细胞。
待碎片沉降后，将含有细胞的上清液转移至新管中。
离心并去除含有碎片的上清液。
用CGNP培养基重悬细胞，并接种至经多聚-D-赖氨酸包被的多孔板孔中。孵育。
与颗粒细胞神经前体细胞（CGNPs）相比，星形胶质细胞在聚-D-赖氨酸涂层上更易贴附并牢固黏附。
震荡培养板并收集含有CGNPs的上清液。离心后弃去上清液。
将CGNPs重悬于CGNP培养基中，并接种至多聚-L-鸟氨酸包被的多孔板中。孵育。
CGNPs 在培养基成分和多聚-L-鸟氨酸的辅助下，附着于包被的表面并增殖。
将三到五个小脑组织转移至15毫升离心管中。在离心前，用含葡萄糖的HBSS缓冲液洗涤小脑组织。离心收集组织。最后一次洗涤后，使用1毫升移液器轻柔吹打两到三次，将小脑组织匀浆化，直至组织碎片大小为0.5至1立方毫米。
轻轻吸去所有液体，直至剩余 2.5 毫升。然后，向含有小脑的 HBSS 葡萄糖溶液管中加入 0.05% 胰蛋白酶，并将组织置于 37 °C 水浴中孵育 15 分钟。每 1 至 3 分钟颠倒一次组织。孵育结束后，加入 5 毫升 cGMP 细胞培养基（CGM）以终止消化，并按前述方法通过离心收集组织。
离心后，弃去上清液，加入1毫升CGM。用1毫升移液器枪头轻轻吹打组织，避免产生气泡。然后加入5毫升CGM，将混合物置于冰上孵育2分钟，使组织残余物沉淀。待组织沉淀后，将上清液转移至新的15毫升离心管中。随后向残留的组织中加入2毫升CGM，重复吹打操作，收集上清液后弃去组织残余物。
将每支15毫升离心管中的组织上清液合并，离心以收集小脑细胞。将沉淀重悬于10毫升CGM培养基中。由于星形胶质细胞贴附于聚-D-赖氨酸的速度和强度均高于cGMPs，因此将最多4毫升细胞悬液加入涂有聚-D-赖氨酸的6孔板孔中，在37摄氏度孵育20分钟，以去除星形胶质细胞。
震荡培养板。将上清液收集至15毫升离心管中，然后按之前步骤离心上清液。将沉淀物重悬于10毫升CGM培养基中，并使用Neubauer计数室进行细胞计数。4至6小时后，贴壁的cGMP细胞呈圆形，并具有增殖能力。将细胞接种于经多聚-L-鸟氨酸包被的培养板中，加入CGM培养基，在37°C、5% CO2及100%相对湿度条件下培养。