由人类多能干细胞生成球形体

从附着在适宜基质上的人多能干细胞（hPSCs）集落开始，在培养基中进行培养。

移除培养基。加入含有特定抑制剂的神经元培养基，并进行孵育。

这些抑制剂可引导hPSCs向神经细胞系分化，形成神经外胚层克隆，后者是称为类球体的小型球形结构的前体。

移去培养基，并用盐缓冲液洗涤。

加入消化酶孵育，使菌落从培养皿上脱离。

加入神经元培养基以终止酶活性。

收集菌落并将其转移至离心管中。

让其静置沉降，然后弃去上清液。

将菌落重悬于含有生长因子的神经元培养基中。

将菌落转移至多孔板中并培养。

这种生长因子促进神经外胚层细胞的自我组装和增殖，使其形成球状体。

首先，将一个6孔板中60%融合度的hPSC集落接种至三个孔的hESC级基底膜基质上，使其密度达到20%至30%，随后进行二维神经外胚层集落的诱导。

接下来3天内，每天向每个孔中加入新鲜的添加了双SMAD抑制剂的N2培养基。为了从诱导的2D神经外胚层克隆生成3D神经外胚层球体，从6孔板中移除2毫升N2培养基，并用HBSS洗涤一次，以确保完全去除所有N2培养基。

向每个含有集落的孔中加入1毫升dispase。将培养板在37摄氏度孵育20至25分钟，并定期检查集落是否脱离。孵育结束后，向孔中加入1毫升N2培养基以终止dispase酶的活性。使用宽口P1000移液枪头或用无菌剪刀修整过的P1000移液枪头，将集落转移至15毫升离心管中，静置使集落团块在重力作用下沉降至管底。

然后，使用标准的 P1000 移液器吸头小心吸去上清液。加入 1 毫升新鲜 N2 培养基，重复洗涤三次，以确保完全去除分散酶。将细胞团块与 N2 培养基重悬后，转移细胞悬液至 6 孔板的一个孔中，并添加 40 纳克/毫升的 bFGF。