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取自新生小鼠小脑中分离的细胞,其中包含干细胞、神经元和胶质细胞。
加入可结合干细胞特异性表面糖蛋白的抗体包被磁性微珠。
离心,去除未结合的珠粒,并将细胞重悬于缓冲液中。
将细胞上样至置于磁力分离器中的分离柱,磁力分离器会保留与微珠结合的干细胞,而其他细胞则流过。
加入神经球培养基以洗脱细胞,并将细胞转移至微孔板中。孵育以诱导形成初级神经球,即具有自我更新能力的干细胞克隆集落。
离心并弃去培养基。用含有消化细胞黏附蛋白酶的培养基重悬神经球。
离心并去除酶。加入神经球培养基,通过机械法解离细胞。
孵育以促进干细胞增殖和继发性神经球形成,而缺乏干细胞特性的分化细胞则不会增殖。
将神经球转移至分化培养基中孵育,以促进其分化为神经元和胶质细胞。
将离心管置于冰上,然后将解离的细胞通过40微米细胞滤筛过滤至50毫升离心管中。用10毫升冰浴的HBSS溶液冲洗滤膜,以确保细胞完全通过滤网。
将过滤后的细胞转移至一个新的15毫升离心管中,在4摄氏度下以300 × g 离心10分钟。然后,使用真空抽吸器彻底去除上清液。
将细胞沉淀重悬于160微升预冷的磁珠柱缓冲液中。向细胞悬液中加入40微升抗prominin-1微珠。然后将离心管置于冰箱中孵育15分钟,使抗体与表达prominin-1的细胞结合。
用1至2毫升柱缓冲液X洗涤细胞,在300 × g 条件下离心10分钟。吸除上清液,将沉淀重悬于1毫升柱缓冲液X中。将磁性柱置于磁力架上,用500微升缓冲液X冲洗一次。将标记的细胞悬液加样至柱中,并用新的15毫升离心管收集穿流液。
用500微升缓冲液X洗涤柱子三次。然后将柱子从磁场中取出,放入1.5毫升离心管中。加入1毫升培养基,并将推杆插入柱子中以冲洗出带有prominin-1磁珠标记的细胞。
传代神经球时,将其连同培养基一起转移至无菌的15毫升离心管中。在300 × g 条件下离心5分钟,使神经球沉淀,弃去上清液。
将沉淀重悬于5毫升含木瓜蛋白酶或0.05%胰蛋白酶的消化液中,37°C孵育10分钟。再次离心细胞悬液。随后,将细胞重悬于5毫升神经球培养基中,使用巴氏吸管缓慢吹打10次以进行解离。按照文本方案所述,将细胞接种于神经球培养基中,并在培养7至10天后,按前述方法通过继代神经球进行富集。