从小鼠大脑中分离荧光标记的神经元

取一只含有表达荧光蛋白神经元的转基因小鼠大脑皮层。

将其固定在样品台上。

将持样器安装在含有充氧人工脑脊液（aCSF）的振动切片机载物盘上，以维持组织的生理状态。

使用设定的参数，获取冠状切片。

将切片置于含有充氧人工脑脊液（aCSF）和活性阻断剂的网状支架中，以稳定切片。

用蛋白酶处理切片，以消化细胞外基质并使细胞松散。

用 aCSF 冲洗以去除蛋白酶。

将切片转移至含有 aCSF 和血清的培养板中。

在荧光显微镜下，解剖含有荧光神经元的切片区域。

将解剖后的组织片段转移至含有 aCSF 和血清的离心管中。

通过机械法解离组织，制备单细胞悬液。将细胞转移至含有aCSF的培养皿中。

在荧光显微镜下，使用毛细移液管收集荧光标记的神经元。

将这些神经元加入含有aCSF的培养板中，用于进一步分析。

用小剪刀打开已处死小鼠的颅骨，使用精细镊子取出新鲜脑组织，注意不要损伤皮层。将脑组织置于冰冷且充氧的人工脑脊液（aCSF）中，并在整个切片过程中保持连接通有5%二氧化碳混合氧气的通气石。

将脑组织置于振动切片机的样品夹上，以300微米厚度切取冠状面或矢状面切片。根据需要收集足够数量的切片，以确保获得至少10至50个标记细胞。将切片置于烧杯内带有棉网的切片架上，使其浸没在充氧的人工脑脊液（aCSF）中。

将切片转移至含有带活性阻断剂aCSF的烧杯中，在室温下用气石通入氧气，孵育15至20分钟。将切片移至含有含蛋白酶溶液aCSF的烧杯中，在室温下进行温和消化。消化完成后，将切片重新移回含有带活性阻断剂aCSF的烧杯中，在室温下孵育5至10分钟以洗去蛋白酶。持续通入氧气。

接下来，准备一个含有1% FBS的室温aCSF的100毫米培养皿，将各组织切片转移至培养皿中以进行显微解剖。在荧光解剖显微镜下，使用一对精细镊子对含有至少10至50个细胞的感兴趣区域和层次进行显微解剖。

使用巴斯德移液管，将显微解剖的组织块转移至含有约 0.8 毫升含 1% FBS 的 aCSF 溶液的 2 毫升微量离心管中。在室温下，用微量离心管对解剖后的组织进行吹打混悬。

使用已火焰消毒的巴斯德吸管，从出口直径最大的开始，到最小的结束，每支吸管操作约10次。将解离的细胞悬液滴入含有充氧人工脑脊液（aCSF）的100毫米培养皿中，静置5至7分钟，待细胞逐渐沉降。

在解剖显微镜下观察 GFP 和 RFP 信号。通过明场照明下检查形态来识别碎片。一旦找到碎片较少的细胞区域，使用毛细管及连接的管路通过用舌头阻断管路阀门末端来吸取细胞。然后将毛细管靠近细胞。松开毛细管的阻断，随即迅速重新阻断，利用毛细作用捕获细胞。

将毛细管转移至含有新鲜含氧人工脑脊液（aCSF）的100毫米培养皿中，在荧光显微镜下观察毛细管尖端的同时，轻轻向管内吹气，以将细胞释放到培养皿中。重复收集操作，直至收集到100至150个细胞，并确保在明场微分干涉差显微镜下观察时，碎片等污染物极少。