0 次观看 • 7:57 分钟 • July 8th, 2025
取一只转基因的怀孕小鼠，通过手术取出含有荧光标记运动神经元的胚胎子宫。
在荧光显微镜下，将子宫转移至含有冰冻缓冲液的培养皿中。
利用可见光分离胚胎。
去除胚胎的面部和尾部，并将其调整为俯卧位。
利用荧光信号，在中脑处进行切口，暴露包含运动神经元的动眼神经核和滑车神经核。
分离包含核团的中脑。
打开后脑和脊髓的背侧。分离脊髓，切除两端，并收集含有脊髓运动神经元的柱状结构。
使用酶处理收集的组织以解离组织基质。收获单细胞，并利用流式细胞术（FACS）分离荧光标记的神经元。
向分离的神经元中加入培养基，将细胞转移至包被有培养基质的微孔板中，孵育以使细胞贴壁并生长。
在培养中维持运动神经元。
从受精后约11.5天的怀孕小鼠体内获取Islet-1 EGF阳性胚胎。用乙醇彻底喷洒腹部，使用无菌显微解剖剪和有齿镊取出子宫。用无菌PBS短暂清洗子宫，然后将其转移至盛有预冷无菌PBS的解剖培养皿中。
在显微镜明亮的光线下，使用显微解剖剪、有齿镊和 Dumont 5 号镊子小心地将胚胎从子宫中取出。然后，用无菌的 Moria 迷你带孔勺将每个胚胎转移至含有预冷的低荧光 Hibernate E 培养基（添加 1X V27）的 24 孔板的各个孔中。
将培养板保持在冰上，将一个胚胎转移至无菌解剖板中，并用预冷的无菌Hank's平衡盐溶液（HBSS）完全覆盖。使用镊子去除胚胎的面部和尾部，注意不要损伤中脑。然后将胚胎腹侧朝下放置，四肢分开，尾部朝向显微镜前方。
使用镊子切开第四脑室的顶部，以形成一个小开口。利用该开口将镊子钩入第四脑室与其顶部之间的空隙中。沿胚胎大脑皮层头侧、底板和运动柱外侧的背侧表面进行解剖。
然后，将解剖好的组织以摊开书本的方式打开，以暴露表达GFP的CN3和CN4核团。用镊子和显微解剖刀小心分离胚胎腹侧中脑，并去除脑膜组织。
从室管膜以及其它GFP阳性周围组织中分离双侧GFP阳性的动眼神经核（CN3）和滑车神经核（CN4），注意避免触碰或损伤神经元。若需分别收集CN3和CN4核团，应沿这两个核团的中脑区域进行切割，并使用P1000移液器收集解剖出的腹侧中脑组织，尽量减少HBSS的残留。
将其放入含有解离培养基的已标记1.7毫升微量离心管中。将试管置于冰上保存，直至进行解离。继续将其他胚胎的腹侧中脑组织收集至同一试管中，直至总数满足实验需求。
解剖腹侧脊髓时，将胚胎保持俯卧位，头部朝向显微镜前方。用一对镊子固定胚胎，并将另一对镊子的尖端插入第四脑室未打开的尾部区域。沿胚胎全长从头侧到尾侧方向，向背侧打开后脑和脊髓。从第四脑室开始，使用镊子作为剪刀，沿背侧组织向尾侧脊髓的中央管方向进行剪切。
然后，用一对镊子夹住胚胎，用另一对镊子从两侧夹除背侧组织的瓣状部分。使用显微解剖刀在GFP阳性SMN正下方直接刺入，通过两侧锯切样动作抬起并移除腹侧脊髓。
在下肢上界处横向切断脊髓，并移除颈腰段。在第一处GFP阳性前角突起的C1节段正上方横向切断。将腹侧脊髓背面向上放置，用镊子夹住GFP阳性SMN柱之间无GFP信号的组织以固定脊髓。
使用显微解剖刀修剪绿色荧光蛋白（GFP）阳性SMN柱的两侧，去除残留的间充质、背根神经节（DRGs）以及背侧脊髓组织。用P1000移液器吸取含有最少体积HBSS的已解剖腹侧脊髓组织，并将其转移至预先标记、盛有解剖培养基的1.7毫升微量离心管中。将组织置于冰上保存直至进行解离，并继续将其他胚胎的腹侧脊髓组织收集至同一管中。
向含有解剖后组织样本的各个微量离心管中加入适量体积的木瓜蛋白酶溶液。将离心管在37摄氏度孵育30分钟，每隔10分钟用手轻轻弹动离心管以振荡混合。
孵育结束后，用 P200 移液器将每种悬液轻柔吹打 8 次。在 300 × g 条件下离心 5 分钟。用适当体积的白蛋白-卵黏蛋白抑制剂溶液通过轻柔吹吸重悬细胞沉淀。重复离心步骤。然后，用 P1000 移液器小心吸除上清液。将细胞重悬于适当体积的解离培养基中。通过 70 微米细胞滤网过滤悬液。
接下来，使用流式细胞分选技术分离自 CN3、CN4 和 SMN 中解剖获得的 GFP 阳性细胞。用预热至 37 摄氏度的运动神经元培养基将分离的细胞悬液稀释至适当密度，并将 200 微升细胞悬液加入多聚赖氨酸-层粘连蛋白包被的 96 孔板中的每个孔。将神经元置于 37 摄氏度、5% 二氧化碳的培养箱中培养，并确保每五天更换一次运动神经元培养基。