从小鼠胚胎中分离与培养动眼神经、滑车神经及脊髓运动神经元

取一只转基因的怀孕小鼠，通过手术取出含有荧光标记运动神经元的胚胎子宫。

在荧光显微镜下，将子宫转移至含有冰冻缓冲液的培养皿中。

利用可见光分离胚胎。

去除胚胎的面部和尾部，并将其调整为俯卧位。

利用荧光信号，在中脑处进行切口，暴露包含运动神经元的动眼神经核和滑车神经核。

分离包含核团的中脑。

打开后脑和脊髓的背侧。分离脊髓，切除两端，并收集含有脊髓运动神经元的柱状结构。

使用酶处理收集的组织以解离组织基质。收获单细胞，并利用流式细胞术（FACS）分离荧光标记的神经元。

向分离的神经元中加入培养基，将细胞转移至包被有培养基质的微孔板中，孵育以使细胞贴壁并生长。

在培养中维持运动神经元。

从受精后约11.5天的怀孕小鼠体内获取Islet-1 EGF阳性胚胎。用乙醇彻底喷洒腹部，使用无菌显微解剖剪和有齿镊取出子宫。用无菌PBS短暂清洗子宫，然后将其转移至盛有预冷无菌PBS的解剖培养皿中。

在显微镜明亮的光线下，使用显微解剖剪、有齿镊和 Dumont 5 号镊子小心地将胚胎从子宫中取出。然后，用无菌的 Moria 迷你带孔勺将每个胚胎转移至含有预冷的低荧光 Hibernate E 培养基（添加 1X V27）的 24 孔板的各个孔中。

将培养板保持在冰上，将一个胚胎转移至无菌解剖板中，并用预冷的无菌Hank's平衡盐溶液（HBSS）完全覆盖。使用镊子去除胚胎的面部和尾部，注意不要损伤中脑。然后将胚胎腹侧朝下放置，四肢分开，尾部朝向显微镜前方。

使用镊子切开第四脑室的顶部，以形成一个小开口。利用该开口将镊子钩入第四脑室与其顶部之间的空隙中。沿胚胎大脑皮层头侧、底板和运动柱外侧的背侧表面进行解剖。

然后，将解剖好的组织以摊开书本的方式打开，以暴露表达GFP的CN3和CN4核团。用镊子和显微解剖刀小心分离胚胎腹侧中脑，并去除脑膜组织。

从室管膜以及其它GFP阳性周围组织中分离双侧GFP阳性的动眼神经核（CN3）和滑车神经核（CN4），注意避免触碰或损伤神经元。若需分别收集CN3和CN4核团，应沿这两个核团的中脑区域进行切割，并使用P1000移液器收集解剖出的腹侧中脑组织，尽量减少HBSS的残留。

将其放入含有解离培养基的已标记1.7毫升微量离心管中。将试管置于冰上保存，直至进行解离。继续将其他胚胎的腹侧中脑组织收集至同一试管中，直至总数满足实验需求。

解剖腹侧脊髓时，将胚胎保持俯卧位，头部朝向显微镜前方。用一对镊子固定胚胎，并将另一对镊子的尖端插入第四脑室未打开的尾部区域。沿胚胎全长从头侧到尾侧方向，向背侧打开后脑和脊髓。从第四脑室开始，使用镊子作为剪刀，沿背侧组织向尾侧脊髓的中央管方向进行剪切。

然后，用一对镊子夹住胚胎，用另一对镊子从两侧夹除背侧组织的瓣状部分。使用显微解剖刀在GFP阳性SMN正下方直接刺入，通过两侧锯切样动作抬起并移除腹侧脊髓。

在下肢上界处横向切断