从小鼠胚胎中分离和培养动眼神经、Trochlear 和脊髓运动神经元

取一只转基因怀孕小鼠，通过手术切除含有荧光标记运动神经元的胚胎的子宫。

荧光显微镜下将子宫转移到装有冰冷缓冲液的培养皿中。

使用可见光分离胚胎。

取出胚胎的面部和尾部，并将它们定向到俯卧位。

使用荧光信号，在中脑切开一个切口，露出包含运动神经元的动眼神经核和滑车核。

分离含有细胞核的中脑。

打开后脑和脊髓的背侧。分离脊髓，切除两端，收集包含脊髓运动神经元的柱子。

用酶处理收集的组织以解离组织基质。收获单细胞并使用 FACS 分离荧光标记的神经元。

将培养基添加到分离的神经元中，将细胞转移到培养底物包被的微孔板上，然后孵育，使细胞粘附和生长。

维持培养中的运动神经元。

首先在受精后约11.5天从怀孕小鼠身上收获Islet-1 EGF阳性胚胎。用乙醇彻底喷洒腹部，然后用无菌显微解剖剪刀和拇指敷料镊子取出子宫。在无菌PBS中短暂清洗子宫。然后，将其转移到装有预冷无菌PBS的解剖板中。

在显微镜的强光下，使用显微解剖剪刀、拇指敷料镊子和 Dumont 5 号镊子小心地将胚胎从子宫中取出。然后，使用无菌 Moria 迷你穿孔勺将每个胚胎转移到 24 孔板的单独孔中，该孔板中装有预冷的 Hibernate E 低荧光培养基，并补充有 1X V27。

将板放在冰上的同时，将一个胚胎转移到无菌解剖板中，并用冰冷的无菌汉克平衡盐溶液或HBSS完全覆盖。使用镊子去除胚胎的表面和尾巴，而不损伤中脑。然后，将胚胎俯卧放置，四肢跨坐在地上，尾巴指向显微镜的前部。

用镊子切开第四脑室的顶部，以产生一个小开口。使用这个开口将镊子钩入第四脑室和其顶部之间形成的空间。沿着胚胎喙侧的背表面解剖至皮层，并横向底板和运动柱。

然后，以开卷方式打开解剖的组织，以显示GFP阳性的CN3和CN4细胞核。小心地将腹侧中脑与胚胎分开，并用镊子和显微解剖刀去除脑膜组织。

双侧GFP阳性CN3和CN4细胞核解剖离底板和其他GFP阳性周围组织，注意避免接触或损伤神经元。如果收集单独的CN3和CN4细胞核，则沿着这两个细胞核的中脑切割，并使用P1000移液器收集解剖的腹侧中脑组织，HBSS最小。

将其放入装有解剖培养基的标记的 1.7 毫升微量离心管中。将试管存放在冰上直至解离。继续将来自同一管中其他胚胎的腹侧中脑汇集在一起，直到总数满足实验要求。

要解剖腹侧脊髓，请保持胚胎俯卧，头部朝向显微镜的前部。用一对镊子握住它，将另一对镊子的尖端插入第四脑室未打开的尾部。在胚胎的整个喙尾范围上向背侧打开后脑和脊髓的其余部分。使用镊子作为剪刀，从第四脑室开始向尾脊髓中央管切割背侧组织。

然后，用一组镊子握住胚胎，用另一对镊子捏掉两侧背组织的皮瓣。使用显微解剖刀直接刺入GFP阳性SMN下方，以锯状运动在两侧抬起腹侧脊髓，从而切除腹侧脊髓。

下肢上边界横切脊髓，切除颈椎腰部。在第一个 GFP 阳性前角突出的 C1 正上方横向切割。将腹侧脊髓背侧朝上放置，并用镊子将GFP阴性组织压在GFP阳性SMN柱之间

用显微解剖刀修剪GFP阳性SMN柱的两侧，去除剩余的附着间充质，DRG和背脊髓。使用P1000移液器收集具有最小HBSS的解剖腹侧脊髓组织，并将其放入装有解剖培养基的标记的1.7毫升微量离心管中。将其储存在冰上直至解离，并继续将来自其他胚胎的腹侧脊髓汇集在同一管中。

适当体积的木瓜蛋白酶溶液添加到装有解剖组织样本的每个微量离心管中。将试管在 37 摄氏度下孵育 30 分钟，每 10 分钟通过手指轻弹搅拌一次试管。

孵育后，用P200移液器轻轻研磨每个悬浮液八次。以 300 倍 g 离心五分钟。通过轻轻上下移液，用适当体积的白蛋白卵粘蛋白抑制剂溶液重悬细胞沉淀。重复离心。然后，用 P1000 移液器小心地去除上清液。将细胞重悬于适当体积的解剖培养基中。通过 70 微米细胞过滤器过滤悬浮液。

接下来，使用 FACS 分选从 CN3、CN4 和 SMN 中分离出 GFP 阳性细胞。用预热至37摄氏度的运动神经元培养基将分离的细胞悬液稀释至适当的密度，并将200微升悬浮液加入PDL层粘连蛋白包被的96孔板的孔中。在37摄氏度和5%二氧化碳培养箱中培养神经元，确保每五天刷新一次运动神经元培养基。